PCR原理傻傻弄不清楚?
PCR實驗步驟看似簡單卻總是做不好?
不知道不同實驗目的該選哪種PCR?
「全線賦能“沃”的實驗」之實驗方法實戰(zhàn)教程
直播第六期為大家講解
《PCR技術》
從技術原理、步驟詳解、類型介紹到應用領域
讓你一場直播課吃透PCR
直播時間
7月5日(周二)19:00
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主題:PCR技術
PCR的原理
實驗步驟
PCR的分類及實際應用
講師:方晟
昆明理工大學碩士研究生,已發(fā)表SCI論文4篇,在載體構建、藥物活性篩選、腫瘤模型構建、單細胞數(shù)據(jù)分析等方面有著豐富的經(jīng)驗,研究方向主要是抗腫瘤藥物的抗癌機理和單細胞測序分析。
上期直播間互動問題
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👇👇
Q1:如何去選擇使用全腦缺血還是局部缺血模型呢?
A1:全腦缺血模型——二血管阻斷法,模擬臨床休克、心功能不全、腦血管嚴重狹窄或阻塞等血液低灌流引起的腦循環(huán)障礙;
全腦缺血模型——四血管阻斷法,海馬損傷明顯,可顯示記憶功能減退;
小鼠全腦缺血/再灌注模型——用于篩選腦活性保護成分或缺血性保護劑的研究;
局灶性腦缺血——栓塞法,適用于血栓形成過程研究及溶栓治療觀察,該方法可選材料多樣,能較好模擬腦栓塞;
局灶性腦缺血——線栓法,急慢性局灶性缺血模型,模擬人類缺血性腦血管病的永jiu性及暫時性局灶性缺血的各種狀態(tài),較適合再灌注作用及相關藥物療效的探究;
局灶性腦缺血——光栓法,適合慢性腦缺血研究,抗血小板、抗血栓等藥物及內(nèi)皮細胞保護等方面的探究,該手術方法創(chuàng)傷小,動物可長時間存活,血栓形成過程與人類相似并且可選擇皮層梗死位置;
局灶性腦缺血——開顱法,適用于腦缺血后長期神經(jīng)功能缺損及介入治療和康復的研究,此模型以大腦皮層、尾狀核缺血最明顯。
Q2:小鼠線栓造模選擇什么規(guī)格的尼龍線?
A2:可以參考如下瑞沃德售賣的尼龍線規(guī)格
線徑(尼龍線號) |
總線長(mm) |
規(guī)格 |
包裝 |
動物體重(g) |
0.10 |
30 |
MSMC19B100PK50 |
50根 |
15~20g小鼠 |
0.10 |
30 |
MSMC21B100PK50 |
50根 |
21~25g小鼠 |
0.12 |
MSMC21B120PK50 |
50根 |
||
0.10 |
30 |
MSMC23B100PK50 |
50根 |
26~30g小鼠 |
0.12 |
MSMC23B120PK50 |
50根 |
||
0.12 |
30 |
MSMC25B120PK50 |
50根 |
31~35g小鼠 |
0.15 |
MSMC25B150PK50 |
50根 |
||
0.15 |
30 |
MSMC26B150PK50 |
50根 |
>35g小鼠 |
Q3:光栓造模光束的功率多少合適呢?
A3:
血管直徑(μm) |
激光波長(nm) |
激光強度(W/cm2) |
染料 (mg/kg體重) |
10-40
|
458-488 |
0.2 |
黃素單核苷酸(37) |
180-240
|
458 |
15 |
黃素單核苷酸(>37) |
10-40
|
514.5 |
11 |
藻紅B(35) |
180-240
|
514.5
|
16
|
孟加拉玫瑰紅(20)
|
700-1400
|
514.5
|
160
|
孟加拉玫瑰紅(40)
|
700-1400
|
514.5
|
50
|
藻紅B(35)
|
10-40
|
532
|
0.2-0.25
|
孟加拉玫瑰紅(10)藻紅B(12.5)
|
50-150
|
532
|
0.5-5.0
|
孟加拉玫瑰紅(10)藻紅B(12.5)
|
180-240
|
532
|
10.0-12.0
|
孟加拉玫瑰紅(20)藻紅B(25)
|
700-1400
|
532
|
130-180
|
孟加拉玫瑰紅(20)藻紅B(25)
|
10-40
|
562
|
0.25
|
孟加拉玫瑰紅(10)
|
180-240
|
562
|
13
|
孟加拉玫瑰紅(20)
|
700-1400
|
562
|
22
|
孟加拉玫瑰紅(40)
|
Q4:MCAO模型成功的判定標準有哪些?
A4:可使用激光散斑血流成像系統(tǒng)或激光多普勒血流儀進行生理學檢測,血流變化率>70%即可初步判斷模型成功,同步配合神經(jīng)行為評分及TTC染色綜合判定。
Q5:如何提高模型的存活率呢,有什么建議呢?
A5:(1)麻醉對死亡率影響較大,推薦使用吸入麻醉;
(2)控制缺血時間,缺血時間過長將導致死亡率的上升;
(3)維持術中及術后體溫,可維持正常生理體征,推薦使用體溫維持儀;
(4)可使用抗生素抗感染。
Q6:大鼠內(nèi)皮素腦內(nèi)注射誘導的局灶性腦缺血模型的操作及坐標點位置?
A6:(1)剪去動物顱頂?shù)拿l(fā),正中線向左旁開 0.2 cm行縱向切口,長約 1.5 cm。剪開皮膚,分離皮下筋膜,暴露顱骨表面,將顱骨骨膜刮除,骨膜處理的好處在于能夠更清楚的觀察骨縫,便于定位和固定,并有助于止血;
(2)將假電極移至 Bregma 點上,然后移動假電極至所需位置,并作好標記;
(3)移開假電極,在標記處用牙科鉆鉆一直徑 1 mm 左右的小孔,以鉆透硬腦膜為度;
(4)在顱骨其他部位鉆兩顆眼鏡螺絲,深度不能超過顱骨厚度。將假電極換成 26-gauge(6.5 號注射針)的套管,按上述定位方法,將套管通過小孔下至硬腦膜,并以此位置為起始,向腹側深入到腦的梨狀皮質內(nèi) MCA 背側 1~2 mm。該位點的參數(shù)為 Bregma 前 0.2 mm,外側 5.2 mm,硬腦膜下 6.1 mm,或 Bregma 后 0.3 mm,外側 5.6 mm,硬腦膜下 7.0 mm、
(5)用牙科水泥將套管固定于螺絲和顱骨上,5%聚維酮碘消毒創(chuàng)面。
Q7:在實驗過程中分離了頸總動脈之后發(fā)現(xiàn)頸外動脈和頸內(nèi)動脈是一上一下的,如何分辨這兩個呢?
A7:頸內(nèi)動脈看似在外,它從血管分叉處延伸出一小段就有向下走的趨勢,基本沒有側枝;頸外動脈看似在內(nèi),相比頸內(nèi)動脈表淺,側枝較多。
Q8:腦缺血造模之后一般可以做什么行為學呢?
A8:
Q9:TTC染色不成功有哪些原因呢?
A9:可能性較多,包括了手術、試劑、染色注意事項、反面、PBS配置等等。如遇到TTC染色不成功,可以從以上各個方面去依次排除原因。
Q10:激光散斑血流成像系統(tǒng)的成像范圍有多大,時間大概需要多久呢?
A10:成像范圍是5.7mm*7.5mm-22.5cm*30cm,成像時間為0.01s/幀,全分辨率采樣速度100FPS。
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