[報(bào)告簡(jiǎn)介]

單細(xì)胞的操縱一直是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，尤其是在不損害細(xì)胞活力的情況下從細(xì)胞中提取細(xì)胞器或?qū)⑼庠次镔|(zhì)直接導(dǎo)入到細(xì)胞中。截止到目前，盡管單細(xì)胞技術(shù)有了較大的發(fā)展，但要實(shí)現(xiàn)將細(xì)胞器從一個(gè)細(xì)胞移植到另一個(gè)細(xì)胞，除了更大的卵母細(xì)胞外，幾乎是不可能實(shí)現(xiàn)的。

線粒體和復(fù)雜的內(nèi)膜系統(tǒng)是真核細(xì)胞的重要特征，是細(xì)胞中能量轉(zhuǎn)換的核心，與細(xì)胞代謝和信號(hào)通路以及細(xì)胞命運(yùn)緊密聯(lián)系在一起。線粒體含有自身的遺傳成分(mtDNA)，通常是嚴(yán)格垂直遺傳給子細(xì)胞的。到目前為止，對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器進(jìn)行操縱十分困難，將線粒體精準(zhǔn)地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的手段有限，對(duì)于線粒體移植后的劑量-反應(yīng)關(guān)系分析更是十分困難，這樣我們就很難從機(jī)制上了解健康或疾病細(xì)胞的線粒體移植后的生物學(xué)效應(yīng)。多功能單細(xì)胞顯微操作FluidFM技術(shù)能夠從活細(xì)胞中提取、注射細(xì)胞器，將定量的線粒體移植到細(xì)胞中，同時(shí)保持它們的活力。

本報(bào)告分為兩部分：

1. 來(lái)自ETH的Dr. Christoph G. Gäbelein使用多功能單細(xì)胞顯微操作FluidFM技術(shù)，將線粒體移植至培養(yǎng)的細(xì)胞中，并實(shí)時(shí)跟蹤線粒體注射后的情況，監(jiān)測(cè)它們?cè)谛滤拗骷?xì)胞中的命運(yùn)。通過(guò)跟蹤發(fā)現(xiàn)被移植線粒體與受體細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)融合發(fā)生在移植后20分鐘，持續(xù)16小時(shí)以上。活細(xì)胞之間移植線粒體不僅為細(xì)胞器生理學(xué)的研究開(kāi)辟了新的前景，也為機(jī)械生物學(xué)、合成生物學(xué)和疾病治療開(kāi)辟了新的前景。本次報(bào)告Dr. Christoph G. Gäbelein將對(duì)上述文章和數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)分享。

2. 2020年9月，國(guó)內(nèi)首套FluidFM多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)在北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院順利安裝并交付使用。期間，在北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院公共儀器中心光學(xué)成像平臺(tái)覃思穎老師和Quantum Design中國(guó)工程師胡西博士的幫助下，成功舉辦多場(chǎng)workshop，F(xiàn)luidFM多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)助力北大發(fā)表多篇paper。本次報(bào)告中，覃思穎老師將分享多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作案例與運(yùn)行維護(hù)經(jīng)驗(yàn)。

[直播入口]

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[報(bào)告時(shí)間]

06月08日 下午15:00-16:00

[主講人介紹]

Christoph G. Gäbelein，ETH

Christoph是一名來(lái)自ETH的青年科學(xué)家，科研中他一直致力于將FluidFM單細(xì)胞顯微操作技術(shù)應(yīng)用于更多的生命科學(xué)場(chǎng)景中。在過(guò)去兩年間，他以一作或參與者的身份發(fā)表了FluidFM多篇文章：

2022 Mitochondria transplantation between living cells

2022 Injection into and extraction from single fungal cells.

2021 Single cell engineering using fluidic force microscopy.

2021 Genome-wide molecular recording using Live-seq.

Christoph對(duì)于FluidFM技術(shù)的應(yīng)用具備豐富而完善的經(jīng)驗(yàn)，文章也是高產(chǎn)的，目前Christoph已經(jīng)成為了FluidFM技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)家。本次Webinar，Christoph將介紹他應(yīng)用技術(shù)的最新成果，并詳細(xì)闡述從活細(xì)胞中提取、注射線粒體，將定量的線粒體移植到細(xì)胞中，同時(shí)保持它們的活力的技術(shù)細(xì)節(jié)。

Christoph的座右銘是：Curiosity-driven young scientist interested in fundamental cell biology

覃思穎，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院公共儀器中心光學(xué)成像平臺(tái)工程師。

2016年于北京大學(xué)獲得生物物理學(xué)博士學(xué)位，博士期間以作者在Nature Materials發(fā)表論文，博士后期間入選首屆北京大學(xué)博雅博士后項(xiàng)目。2019年加入北京大學(xué)生科院公共儀器中心，負(fù)責(zé)原子力顯微鏡、多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)、共聚焦顯微鏡等大型儀器的技術(shù)支持與運(yùn)行管理，在多尺度生物樣品的原子力制樣與成像力學(xué)檢測(cè)、單細(xì)胞注射與分離等顯微操作、生物熒光成像與圖像處理分析等方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，為校內(nèi)外100余課題組提供技術(shù)服務(wù)，輔助課題組在Nature、Cell、Nature Cell Biology等國(guó)際期刊發(fā)表論文30余篇。本次報(bào)告將分享多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)FluidFM技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作案例與運(yùn)行維護(hù)經(jīng)驗(yàn)。

[應(yīng)用簡(jiǎn)介]

1. 從活細(xì)胞中提取線粒體

為了檢測(cè)FluidFM探針對(duì)單細(xì)胞細(xì)胞器采樣的能力。作者使用了兩種探針，分別是錐型探針(A=1.2 μm²)和圓柱型探針(A=1.6 μm²)(圖1B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用這兩種探針都可以對(duì)單個(gè)線粒體及多個(gè)線粒體進(jìn)行提取或大量抽提。
 

圖1：(A) 示意圖：使用FluidFM技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞器提取。通過(guò)調(diào)整懸臂探針中的負(fù)壓(-Δp)進(jìn)行提取。(B) 通過(guò)調(diào)節(jié)孔徑大小和流體作用力的適用范圍，選擇性地提取不同的細(xì)胞器成分。第1行：用懸梁臂探針提取單細(xì)胞細(xì)胞器的示意圖。第2行：不同孔徑的懸臂尖掃描電鏡圖。第3行：FluidFM懸臂探針孔徑與對(duì)應(yīng)的流體力范圍。(C) 示意圖：使用FluidFM技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞器注射。通過(guò)調(diào)整懸臂探針中的正壓(+Δp)進(jìn)行將探針中的細(xì)胞器注射到受體細(xì)胞內(nèi)。

對(duì)線粒體提取后的細(xì)胞活力進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞仍保持較高的細(xì)胞活力 (>95%)。為了進(jìn)一步確保FluidFM提取方案在探針插入時(shí)不會(huì)破壞細(xì)胞質(zhì)膜，作者使用熒光探針(mito-R-GECO1)監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中可能發(fā)生的Ca²⁺內(nèi)流。實(shí)驗(yàn)顯示，在操作過(guò)程中和操作后都沒(méi)有Ca²⁺流入，表明細(xì)胞器提取過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)膜的完整性。

本研究還發(fā)現(xiàn)暴露在FluidFM負(fù)壓下的線粒體小體會(huì)經(jīng)歷形狀的轉(zhuǎn)變，類(lèi)似于“串上珍珠”的形態(tài)。 其特征是離散的線粒體基質(zhì)球體狀，并且通過(guò)細(xì)長(zhǎng)的膜結(jié)構(gòu)相互連接，在進(jìn)一步負(fù)壓拉力的作用下，這些球狀結(jié)構(gòu)最終被拉斷，并在懸臂中呈現(xiàn)為球狀線粒體(圖2E)。進(jìn)一步探究顯示，施加FluidFM負(fù)壓后，力誘導(dǎo)的形狀轉(zhuǎn)變沿線粒體小管在毫秒到秒的范圍內(nèi)傳播了數(shù)十微米。形狀轉(zhuǎn)變沿這一方向均勻傳播，而外層線粒體膜(OMM)保持了最初的完整性。當(dāng)牽引力保持?jǐn)?shù)秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之間的一個(gè)或多個(gè)收縮點(diǎn)分離，從而產(chǎn)生獨(dú)立的球形線粒體，而管狀結(jié)構(gòu)的其余部分放松并恢復(fù)。結(jié)合線粒體牽引實(shí)驗(yàn)和線粒體定位的鈣流實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明線粒體的串上珍珠表型的形狀轉(zhuǎn)變以及隨后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的線粒體裂變是不依賴鈣的。
 

圖2(A) FluidFM懸臂探針的掃描電子顯微鏡圖像。具體尺寸參數(shù)是：L = 200 μm, W = 35 μm, H = 1 μm。Scale bar = 5 μm。(B) 提取線粒體后的FluidFM懸臂的熒光顯微鏡圖像。由于折射率不同，可以看到提取物和懸臂探針填充物之間的邊界。Scale bar = 10 μm。(C) 是圖(B)的示意圖，提取物的體積是1170 fL。(D- F) 活細(xì)胞器提取的延時(shí)圖像和提取后金字塔懸臂圖像。黃框表示細(xì)胞內(nèi)的懸臂尖的位置。(D) 對(duì)表達(dá)su9-BFP(線粒體)和Sec61-GFP (ER) 的U2OS細(xì)胞進(jìn)行提取。箭頭表示ER區(qū)域。使用孔徑為0.5 µm²的懸臂梁探針。Scale bar = 10 μm。(E) 從表達(dá)su9-BFP的U2OS細(xì)胞中提取單個(gè)線粒體。使用1 µm²孔徑的懸臂梁探針。Scale bar = 10 μm。(F) 從表達(dá)su9-BFP的U2OS細(xì)胞中提取數(shù)個(gè)線粒體。使用1 µm²孔徑的懸臂梁探針。Scale bar = 10 μm。

2. 將線粒體移植至新細(xì)胞

研究人員的下一個(gè)目標(biāo)是將線粒體移植到新的宿主細(xì)胞中，并保持細(xì)胞活性。FluidFM技術(shù)為線粒體轉(zhuǎn)移提供了兩種可能性方案：方案一、用FluidFM技術(shù)直接提取線粒體而后注入到新的宿主細(xì)胞中；方案二、將從細(xì)胞中分離純化的線粒體回充入FluidFM探針，然后注射(圖3A-D)。作者比較了兩種方法，為了實(shí)現(xiàn)可視化的線粒體的轉(zhuǎn)移，作者在供體和受體細(xì)胞中分別對(duì)線粒體進(jìn)行了差異化標(biāo)記 (圖3E-F; 供體細(xì)胞線粒體su9-mCherry和受體細(xì)胞線粒體su9-BFP)。當(dāng)使用FluidFM直接將線粒體從一個(gè)細(xì)胞移植到另一個(gè)細(xì)胞時(shí)，成功率高達(dá)95%，而且保持了細(xì)胞活力(圖3G, 41個(gè)移植細(xì)胞中有39個(gè))。在注射純化線粒體后，作者觀察到46%的樣本(19/41)發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)移且保持了細(xì)胞活力(圖3G)。移植的定量結(jié)果顯示，這些實(shí)驗(yàn)中移植的線粒體數(shù)量從3到15個(gè)線粒體每個(gè)細(xì)胞不等(圖3H)。兩種替代方案的不同成功率可以由線粒體分離獲取的條件差異來(lái)解釋。在評(píng)估線粒體提取方案時(shí)，作者觀察到部分提取的線粒體外膜發(fā)生破裂。線粒體的不可逆損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)降解，細(xì)胞色素C釋放可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

雖然線粒體的細(xì)胞間移植降低了通量，但它的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞外時(shí)間短(<1分鐘)，并且通過(guò)FluidFM采樣的線粒體最大限度地集中在原生細(xì)胞質(zhì)液中，完全避免了人工緩沖液的使用。在提取和移植之前，作者通過(guò)在探針中填充不混溶的C8F18來(lái)確保提取液在提取過(guò)程中保持在孔徑附近。因此，只有很小的體積(0.5 - 2pL)被注入到宿主細(xì)胞中(圖3B)。

除了標(biāo)記供體細(xì)胞的線粒體(su9-mCherry)外，還標(biāo)記了受體細(xì)胞的線粒體(su9- BFP)，這樣就能夠觀察移植細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)的實(shí)時(shí)狀態(tài)。在上述兩種移植方案(移植和純化后注射)中，宿主-線粒體網(wǎng)絡(luò)的管狀狀態(tài)不會(huì)因注射過(guò)程而產(chǎn)生影響。此外，標(biāo)記可以讓作者可視化地監(jiān)測(cè)線粒體地移植，觀察線粒體地融合。 無(wú)論移植方法是細(xì)胞到細(xì)胞(圖3I)，還是注射純化線粒體(圖3J)，都可以觀察到這些過(guò)程。實(shí)驗(yàn)跟蹤了22個(gè)細(xì)胞的移植命運(yùn)：18個(gè)細(xì)胞顯示移植的線粒體完全融合，4個(gè)細(xì)胞的線粒體發(fā)生降解。多數(shù)細(xì)胞樣本(18個(gè)細(xì)胞中的14個(gè))在移植后30分鐘內(nèi)首次觀察到融合事件。

如上所述，細(xì)胞間移植即方案一的效率高，并可以直接觀察單個(gè)移植線粒體的命運(yùn)。為了展示這一點(diǎn)，作者將標(biāo)記好的線粒體(su9-mCherry)從HeLa細(xì)胞移植到差異標(biāo)記的U2OS細(xì)胞(su9-BFP)中，這種細(xì)胞通常用于研究動(dòng)態(tài)線粒體行為。高靈敏度相機(jī)可以用于追蹤受體細(xì)胞內(nèi)的單個(gè)線粒體(圖3L)。作者觀察到熒光線粒體基質(zhì)標(biāo)簽在移植后23分鐘的發(fā)生初始融合而后擴(kuò)展到線粒體網(wǎng)絡(luò)。

綜上所述，作者建立了兩種將線粒體轉(zhuǎn)移到單個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的方法。 一種方法是活細(xì)胞間移植。該方案顯示移植后細(xì)胞活力高，允許觀察移植后線粒體的動(dòng)態(tài)行為，是一種高效方案。第二種方法是大量純化線粒體并將其注射到受體細(xì)胞中。 注射速度相當(dāng)快，但不可避免地?fù)p害線粒體和細(xì)胞功能。
 

圖3(A) 方案一示意圖（活細(xì)胞間線粒體移植）：通過(guò)FluidFM吸入法提取線粒體。 隨后，將帶有提取物的懸臂探針移至受體細(xì)胞插入并注入提取物。(B) 方案一預(yù)填充C8F18的FluidFM懸臂梁的圖像，被移植線粒體通過(guò)su9-mCherry標(biāo)記，提取量~0.8 pL。Scale bar = 10 μm。(C) 方案二示意圖（純化線粒體注入細(xì)胞）：使用標(biāo)準(zhǔn)線粒體純化方案純化的線粒體進(jìn)行線粒體移植的方案。 將純化的線粒體重懸在HEPES-2緩沖液中，直接填充到FluidFM探針中并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行注射。(D) 方案二由su9-mCherry標(biāo)記的FluidFM懸臂充滿線粒體的圖像。Scale bar = 10 μm。(E) 通過(guò)方案一（活細(xì)胞間線粒體移植）進(jìn)行線粒體移植后的宿主細(xì)胞圖像。宿主細(xì)胞的線粒體通過(guò)su9-BFP標(biāo)記，移植細(xì)胞線粒體通過(guò)su9-mCherry標(biāo)記。Scale bar = 10 μm。(F) 通過(guò)方案二（純化線粒體注入細(xì)胞）進(jìn)行線粒體移植后的受體細(xì)胞圖像。宿主細(xì)胞的線粒體通過(guò)su9-BFP標(biāo)記，移植細(xì)胞線粒體通過(guò)su9-mCherry標(biāo)記。Scale bar = 10 μm。(G) 通過(guò)光學(xué)成像對(duì)兩種方案注射的細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估。每種方法評(píng)估了40個(gè)細(xì)胞。(H) 兩種方案的線粒體的絕對(duì)計(jì)數(shù)評(píng)估。每種方法評(píng)估了22個(gè)細(xì)胞。(I) 方案一移植線粒體后，對(duì)移植線粒體(su9-mCherry)和宿主線粒體網(wǎng)絡(luò)(su9-BFP)使用不同的熒光標(biāo)記進(jìn)行成像，融合。Scale bar = 5μm。(J) 方案二注入純化線粒體后移的融合狀態(tài)，標(biāo)記方案同(I)。Scale bar = 5 μm。(K) 移植線粒體發(fā)生降解，分裂成多個(gè)更小的熒光囊泡(su9-mCherry)，熒光與標(biāo)記的宿主細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)(su9-BFP)沒(méi)有重疊。Scale bar=5 μm。 (L) 單個(gè)移植線粒體的延時(shí)圖像序列(su9-mCherry)。細(xì)胞器供體為HeLa細(xì)胞，受體細(xì)胞為U2OS細(xì)胞，帶有熒光標(biāo)記線粒體網(wǎng)絡(luò)(su9-BFP)。Scale bar = 10 μm。 

討論

FluidFM技術(shù)采用微型探針，可以在微環(huán)境中以高時(shí)空分辨率操縱單細(xì)胞或者對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行采樣，并與組學(xué)方法相結(jié)合，使細(xì)胞器的研究成為可能。FluidFM技術(shù)將原子力顯微鏡的高精度力學(xué)調(diào)節(jié)手段與光學(xué)檢測(cè)下的納米尺度微流控系統(tǒng)相結(jié)合，提供與單細(xì)胞操作相關(guān)的力學(xué)和定量的體積控制。這些特性在現(xiàn)有微型探針中是的，在本研究中，作者將FluidFM單細(xì)胞技術(shù)用于活細(xì)胞真核內(nèi)和細(xì)胞間的細(xì)胞器微操作。成功實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞之間的線粒體移植。

該研究將啟發(fā)人們將FluidFM技術(shù)應(yīng)用于更多領(lǐng)域，例如，干細(xì)胞治療中低代謝活性細(xì)胞的再生，作為線粒體替代治療方法的一種備選方案等。此外，F(xiàn)luidFM技術(shù)為解決細(xì)胞生物學(xué)、生物力學(xué)和細(xì)胞工程等問(wèn)題提供了新的視角。

相關(guān)產(chǎn)品
1、多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)- FluidFM OMNIUM