AAV核酸滴度定量檢測知多少

隨著基因治療技術(shù)日趨完善和臨床經(jīng)驗不斷積累，監(jiān)管機(jī)構(gòu)對基因治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制也愈發(fā)嚴(yán)謹(jǐn)慎微。準(zhǔn)確的滴度檢測是AAV基因治療藥物質(zhì)控的重要組成部分，也是開展臨床研究的前提條件，AAV基因治療臨床試驗檢測方法匯總?cè)缦卤怼?br />  

	檢測項目	檢測方法
一般理化指標(biāo)	外觀	直接檢測法
	pH	電位滴定法
	滲透壓	滲透壓測定法
純度	蛋白含量	SDS-PAGE/銀染
	病毒顆粒聚集體	動態(tài)光散射
	空殼率	透射電鏡
	OD260/OD280	分光光度計法
	宿主DNA殘留	qPCR
	質(zhì)粒DNA殘留	qPCR
	HKE293/BSA	ELISA
	核酸酶	ELISA
性能	核酸滴度	qPCR
	轉(zhuǎn)染效率/感染滴度	TCID50
	基因表達(dá)	ELISA
	體外活性
安全性	內(nèi)毒素	凝膠限度試驗法
	無菌	培養(yǎng)法
	復(fù)制型AAV	培養(yǎng)法

其中核酸滴度檢測是以AAV衣殼中所含基因組作為定量依據(jù)，測定的是含有目標(biāo)基因組的AAV濃度。AAV中包含的基因組是其表達(dá)蛋白或RNA的前提，是AAV藥物發(fā)揮藥效的核心和基礎(chǔ)。目前AAV核酸滴度檢測方法有點(diǎn)雜交法、分光光度計法和qPCR法，qPCR作為第二代PCR方法，是各大研究機(jī)構(gòu)和藥企最廣泛采用的定量方法。然而qPCR技術(shù)存在較大局限性，如檢測結(jié)果只是相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的“相對”定量，且反應(yīng)容易受qPCR體系中酶或蛋白等成分的干擾，定量結(jié)果不夠精準(zhǔn)等。
 
ddPCR方法 vs qPCR方法
數(shù)字PCR（ddPCR）被稱為第三代PCR技術(shù)，與qPCR技術(shù)相比具有以下顯著優(yōu)勢：

• ddPCR無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可對目標(biāo)分子進(jìn)行絕對定量；
• ddPCR有更高的準(zhǔn)確度，定量CV值通常小于10%；
• ddPCR抗干擾能力更優(yōu)，有實驗顯示，ddPCR檢測AAV樣本的穩(wěn)定性高于qPCR技術(shù)^[1]。

 
另一組測試數(shù)據(jù)也顯示^[2]，優(yōu)化后的qPCR方法中位CV分別為5.35%和4.37%，最大值分別為33.2%和8.7%，而數(shù)字PCR用三個獨(dú)立引物探針組的中位CV值為2%或更低，且分布更密集，可見數(shù)字PCR方法定量更加準(zhǔn)確，重復(fù)性更高。
 
從監(jiān)管趨勢來看，美國藥典在細(xì)胞和基因治療標(biāo)準(zhǔn)品章節(jié)中明確寫道，AAV標(biāo)準(zhǔn)品定量將會使用數(shù)字PCR進(jìn)行定量，可見數(shù)字PCR方法在細(xì)胞和基因治療領(lǐng)域中絕對定量的突出優(yōu)勢。
   
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綜上所述，在以AAV為遞送載體的基因治療產(chǎn)品的定量檢測中，ddPCR技術(shù)已受到越來越多業(yè)內(nèi)人士的青睞，為了滿足廣大客戶的需求，達(dá)普生物即將推出其自主研發(fā)的AAV基因組ddPCR精準(zhǔn)定量試劑盒。北京西美杰科技有限公司作為達(dá)普生物中國總代理，現(xiàn)攜手達(dá)普生物開展“AAV核酸滴度數(shù)字PCR定量試劑盒免費(fèi)測試活動”。
 
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達(dá)普生物科技有限公司由多位海歸博士共同創(chuàng)立。在深圳、嘉興、香港三地設(shè)有研發(fā)中心，擁有微流控芯片、儀器及試劑 GMP 廠房。公司專注于將液滴微流控技術(shù)應(yīng)用于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，致力于成為集微流控芯片、儀器、試劑的研發(fā)和生產(chǎn)于一體的完整解決方案提供商。公司自主研發(fā)、生產(chǎn)的兩大技術(shù)平臺：數(shù)字 PCR 系統(tǒng)和單細(xì)胞組學(xué)系統(tǒng)。產(chǎn)品適合應(yīng)用于癌癥早期篩查、靶向治療、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷、病毒定量檢測、高通量藥物和抗體篩選等領(lǐng)域。
 
參考文獻(xiàn)：

1. Dobnik, David, et al.2019:1570.，Dobnik, David, et al. "Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors." Frontiers in microbiology (2019): 1570.
2. Martin Lock, Mauricio R. Alvira, Shu-Jen Chen, and James M. Wilson. Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.HUMAN GENE THERAPY METHODS 25:115–125 (April 2014)