當(dāng)國(guó)內(nèi)抗擊新型冠狀病毒已經(jīng)取得階段性勝利，各地方政府推出各種積極鼓勵(lì)政策，普及全民免費(fèi)接種新冠病毒疫苗的時(shí)候，當(dāng)?shù)貢r(shí)間2021年5月3日，剛果（金）衛(wèi)生部宣布，該國(guó)第12輪埃博拉疫情結(jié)束......
 

“國(guó)民男神”張文宏醫(yī)生曾與樊登對(duì)話時(shí)指出：“如果今年新冠的死亡率、病死率，是像埃博拉一樣的，其實(shí)這個(gè)病還是比較容易控制的。”
 

埃博拉病毒，一個(gè)既熟悉又陌生的名字。
 

埃博拉病毒（EBOV）是一種膜包被的負(fù)單鏈RNA病毒，屬于Filoviridae家族，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白。該病毒在人類和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中可引起嚴(yán)重的出血性發(fā)熱、腹瀉、嘔吐、肌痛、肝腎功能損傷等臨床癥狀。迄今為止，已確定6種埃博拉病毒，包括扎伊爾型埃博拉病毒（ZEBOV），該病毒對(duì)人類的致死率最高，死亡率為60％ ~ 90％。2014年至2016年，西非國(guó)家利比亞、幾內(nèi)亞和塞拉利昂曾爆發(fā)了最大規(guī)模的埃博拉病毒，導(dǎo)致超過(guò)28000人感染，11000人死亡。這次爆發(fā)主要是由扎伊爾型埃博拉病毒所引起，世界衛(wèi)生組織（WHO）宣布進(jìn)入國(guó)際關(guān)注的公共衛(wèi)生緊急狀態(tài)。2021年2月至5月，剛果（金）民主共和國(guó)北基伍省共發(fā)現(xiàn)確診病例12例，其中死亡6例。埃博拉疫情能被一次又一次得到有效控制，死亡率降低，感染人數(shù)減少，不得不說(shuō)，很大一部分原因是得益于埃博拉疫苗的普及。
全球第一個(gè)上市預(yù)防埃博拉病毒病的商品化疫苗ERVEBO®，即rVSV∆G-ZEBOV-GP疫苗，2019年已獲得歐盟EMEA和美國(guó)FDA批準(zhǔn)使用。此疫苗由Merck公司研發(fā)生產(chǎn)，采用多種創(chuàng)新性的技術(shù)。其疫苗分析研究進(jìn)展與疫苗工藝開(kāi)發(fā)和商業(yè)化部門于2020年8月發(fā)表題為Characterization of rVSV∆G-ZEBOV-GP glycoproteins using automated capillary western blotting的文章， 披露了利用全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot技術(shù)平臺(tái)表征rVSV∆G-ZEBOV-GP糖蛋白的詳細(xì)技術(shù)細(xì)節(jié)。

研究背景

EBOV主要通過(guò)由病毒糖蛋白（GP）介導(dǎo)的相互作用來(lái)感染宿主細(xì)胞。EBOV基因組由于轉(zhuǎn)錄停頓可產(chǎn)生三種不同的包膜GP變體。未編輯的RNA轉(zhuǎn)錄編碼一個(gè)非結(jié)構(gòu)分泌型GP（sGP）蛋白。開(kāi)放閱讀框（ORF）的+1轉(zhuǎn)變，可產(chǎn)生一個(gè)結(jié)構(gòu)上重要的病毒膜結(jié)合型GP蛋白。最后，ORF的+2轉(zhuǎn)變，可產(chǎn)生一個(gè)非結(jié)構(gòu)小型分泌型GP（ssGP）。每種蛋白在致病機(jī)制方面的作用先前已經(jīng)描述。EBOV GP合成為一個(gè)多肽，被一種類似呋喃的蛋白酶裂解，生成一個(gè)異質(zhì)二聚體，由GP1和GP2亞基組成，通過(guò)一個(gè)二硫鍵連接在一起。ZEBOV包膜GP蛋白的表面含有17個(gè)N-連接糖和許多糖基化位點(diǎn)。GP1負(fù)責(zé)與細(xì)胞受體的結(jié)合，有三個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)受體結(jié)合域、一個(gè)糖帽和一個(gè)非結(jié)構(gòu)性的重度O型糖基化區(qū)域（粘蛋白樣結(jié)構(gòu)域）。GP2有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與病毒的融合。GP2∆，發(fā)現(xiàn)于脫落GP蛋白，是TNF-a轉(zhuǎn)換酶（TACE）對(duì)GP2進(jìn)行酶切的結(jié)果。EBOV的細(xì)胞進(jìn)入機(jī)制，是由組織蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶介導(dǎo)的，它裂解完整的EBOV GP1，去除糖帽和粘液蛋白結(jié)構(gòu)域，暴露出增加受體結(jié)合和病毒感染性的氨基酸殘基。
 

該項(xiàng)研究闡述了在整個(gè)rVSV∆G-ZEBOV-GP疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，使用全自動(dòng)定量毛細(xì)管Western Blot檢測(cè)平臺(tái)，研究和表征ZEBOV糖蛋白。自動(dòng)化Western Blot與傳統(tǒng)手工Western Blot技術(shù)平臺(tái)相比有諸多優(yōu)點(diǎn)：
 

1. 線性范圍增加

2. 更高的通量

3. 因自動(dòng)化而增強(qiáng)的重復(fù)性
    

由于該技術(shù)的高特異性，毛細(xì)管Western Blot技術(shù)已被應(yīng)用于疫苗產(chǎn)品和治療性蛋白質(zhì)的表征。該項(xiàng)目中，研究人員還進(jìn)行了方法學(xué)對(duì)比，對(duì)比了傳統(tǒng)手動(dòng)Western Blot技術(shù)與全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot檢測(cè)技術(shù)。

研究結(jié)論


我們已開(kāi)發(fā)和應(yīng)用基于全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot檢測(cè)方法，去開(kāi)發(fā)及生產(chǎn)ERVEBO®疫苗。使用該方法表征在疫苗生產(chǎn)的過(guò)程中，GP變體的類型和數(shù)量。毛細(xì)管Western Blot技術(shù)提供了與傳統(tǒng)手動(dòng)Western Blot系統(tǒng)相似的GP結(jié)果。但是，具有更好的重復(fù)性，更準(zhǔn)確的定量，并更簡(jiǎn)單易用。該方法有助于表征疫苗生產(chǎn)中酶促反應(yīng)步驟，評(píng)估下游純化步驟中的變化，并確認(rèn)多批次間的工藝穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)表明，使用VSV載體產(chǎn)生的GP、sGP和ssGP的相對(duì)數(shù)量與天然埃博拉病毒中觀察到的不同。GP蛋白是在感染期間產(chǎn)生的，只有病毒粒子膜結(jié)合的GP包含在rVSVΔG-ZEBOV-GP疫苗最后的DP中。毛細(xì)管Westerns表明，ERVEBO®生產(chǎn)過(guò)程中的每個(gè)步驟都有獨(dú)特的電泳圖，該方法可以作為一個(gè)有利的工具，去評(píng)估生產(chǎn)過(guò)程的不同階段。

方法學(xué)對(duì)比


根據(jù)工序，rVSV∆G-ZEBOV-GP使用1x樣品緩沖液中稀釋至7倍。初步稀釋后，將樣品在2個(gè)混合物（含樣品緩沖液、二硫蘇糖醇和熒光標(biāo)準(zhǔn)品）中稀釋2倍，在70℃下加熱10分鐘。隨后，樣品經(jīng)短暫渦旋去除氣泡后，加載到12-230 kDa的樣品板上。一抗（兔抗ZEBOV-GP）母液被加載到樣品板前，用抗體稀釋液（終濃度為2μg/mL）稀釋1000倍。毛細(xì)管Western Blot儀器采購(gòu)于ProteinSimple公司（Santa Clara, CA, USA）。儀器設(shè)置定義如下：分離時(shí)間設(shè)置為30分鐘，一抗體孵育時(shí)間為30至60分鐘，二抗體孵育時(shí)間為30至60分鐘。使用儀器的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)通道在不同的曝光長(zhǎng)度下進(jìn)行檢測(cè)。除非另有規(guī)定，曝光時(shí)間為2s。所有未指定的設(shè)置均采用供應(yīng)商的默認(rèn)選項(xiàng)。

Merck早在2012年就曾發(fā)表文章指出，對(duì)比傳統(tǒng)手動(dòng)WB （羅氏于2005年發(fā)表：CV > 35%），ProteinSimple全自動(dòng)Western Blot檢測(cè)平臺(tái)的數(shù)據(jù)CV值可以控制在10%以內(nèi)。

結(jié)果展示

(A) 收獲病毒液（HVF：Harvested virus fluid）為工藝流程中最早的步驟，即病毒轉(zhuǎn)染后收獲。包含：GP1（260 kDa）、未知（190 kDa）、可溶性GP（95 kDa）和GP2 + GP2∆（40 kDa）；
 

(B) 澄清病毒液（CVH：Clarified viral harvest）為工藝流程中的第二步，過(guò)死端過(guò)濾以去除細(xì)胞碎片和樣品。包含：GP1（260 kDa）、可溶性GP（95 kDa）和GP2 + GP2∆（40 kDa），未知的190 kDa峰被去除；
 

(C) 反應(yīng)后病毒收獲（RVH：Reacted viral harvest ），在純化過(guò)程的酶解步驟之后。包含：由胰蛋白酶處理的GP1、可溶性GP（95 kDa）、GP2 + GP2∆（40 kDa）和較低分子量的蛋白質(zhì)（<12 kDa）組成，可能是胰蛋白酶處理后產(chǎn)生的GP1片段；
 

(D) 超濾產(chǎn)品（UFP：Ultrafiltration product），樣品被超濾后。包含：GP1（95 kDa）和GP2（40 kDa），所有可溶性GP和脫落的GP被去除；
 

(E) 藥物產(chǎn)品（DP: Drug product），通過(guò)加入Tris和rHSA （recombinant Human Serum Albumin:重組人血清白蛋白）稀釋DS（Drug substance：原藥）至目標(biāo)濃度。
 

包含：GP1（95 kDa）和GP2（40 kDa），由于rHSA與一抗的交叉反應(yīng)，DP中觀察到一個(gè)約60 kDa的rHSA峰，DP濃度比UFP中低約2-logs。原藥電泳圖（補(bǔ)充信息圖.1S）與UFP相似，因?yàn)槠錆舛扰cUFP相似，盡管含有rHSA作為穩(wěn)定劑。
 

圖片中的峰高經(jīng)過(guò)調(diào)整，以最好地呈現(xiàn)出每個(gè)樣品。

A) 胰蛋白酶處理CVH樣品時(shí)間過(guò)程電泳圖，GP1峰在10分鐘內(nèi)從260 kDa轉(zhuǎn)移到95 kDa，隨著時(shí)間的推移，峰面積持續(xù)減少；

(B) 加入胰蛋白酶抑制劑后結(jié)果，RVH樣品在室溫下進(jìn)行Hold Time Study。在168小時(shí)內(nèi)，GP1峰值持續(xù)緩慢下降。

(A) 四個(gè)不同批次的CVH中GP和可溶性GP的峰面積百分比；

(B) 其中一個(gè)批次的CVH的電泳圖，顯示峰值積分和分配；

(C) 四個(gè)不同批次的UFP樣品，顯示峰面積分布；

(D) UFP樣品的電泳圖，顯示峰值積分整合和分配。四個(gè)批次CVH樣品中，GP（包括GP1和GP2+GP2Δ）占總峰面積的78%，可溶性GP平均占22%。
 

全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot技術(shù)平臺(tái)展望
 

后疫情時(shí)代，我們依然需要居安思危，對(duì)科學(xué)與自然保持敬畏之心。潛心開(kāi)發(fā)傳統(tǒng)疫苗、亞單位疫苗、聯(lián)合疫苗、核酸疫苗和治療性疫苗，惠及人民。作為地球人，疾病無(wú)國(guó)界，先進(jìn)技術(shù)無(wú)國(guó)界，愛(ài)與幫助也同樣無(wú)國(guó)界。國(guó)外成熟的疫苗研發(fā)與生產(chǎn)技術(shù)路線，值得我們學(xué)習(xí)和借鑒。
 

ProteinSimple全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot技術(shù)平臺(tái)，已被眾多科研工作者使用，從事人用和獸用疫苗相關(guān)研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)控，包括埃博拉病毒疫苗，狂犬病病毒疫苗，肺結(jié)核病病毒疫苗，新型人乳頭瘤病毒疫苗，SARS-CoV-2疫苗等等。正如ERVEBO®生產(chǎn)整個(gè)過(guò)程中，全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot技術(shù)平臺(tái)可呈現(xiàn)出獨(dú)特的電泳圖，去評(píng)估疫苗生產(chǎn)過(guò)程的不同階段。其高質(zhì)量高重復(fù)性數(shù)據(jù)（CV < 10%）、全自動(dòng)高通量快速檢測(cè)流程（25個(gè)樣品僅需3h，最高通量為96個(gè)樣品）、超微量樣品（僅需3ul）、除分子量分離外，可兼容等電點(diǎn)分離的靈活應(yīng)用，等等諸多優(yōu)勢(shì)，使得全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot技術(shù)平臺(tái)逐漸取代傳統(tǒng)手工Western Blot檢測(cè)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于疫苗領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：
1. Characterization of rVSVΔG-ZEBOV-GP glycoproteins using automated capillary western blotting, K. Minsker, R. Rustandi, S. Ha and J. Loughney, Vaccine, 2020; 38(45):7166–7174.

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