默克公司PPDM ADME Biologics部門利用全自動Western blot系統(tǒng)Wes，研究納米抗體早期ADA免疫原性評估，文章發(fā)表在Journal of Pharmacological and Toxicological Methods：A capillary electrophoresis based approach for the identification of anti-drug antibodies against camelid VHH biologics (Nanobodies®), J Pharmacol Toxicol Methods. May-Jun 2020;103:106872.
 

--研究背景--

納米抗體（Nanobody）：除了由包含兩個重鏈和兩個輕鏈的四個亞基組成的正常異四聚體抗體以外，駱駝科動物會產(chǎn)生獨特的僅重鏈的抗原結(jié)合蛋白，其單個可變域（VHH）大小約為15kDa。納米抗體是分離的VHH結(jié)構(gòu)域，可以與短肽序列連接在一起，形成具有多對位或多特異性結(jié)合特性的多價模塊化構(gòu)建體。因此，納米抗體被評估為潛在的生物治療方法。
 

抗藥物抗體（Anti-drug-antibody，ADA）：蛋白質(zhì)類藥物的特異性，以及可調(diào)節(jié)的定位和靶向特性極大的改變了原有的藥物臨床使用領(lǐng)域。但基于蛋白質(zhì)本身獨特的復(fù)雜性，其藥物制劑勢必會具有引起抗藥物抗體應(yīng)答（ADAs）的潛力。而ADA的產(chǎn)生，對藥物暴露、藥物毒性作用、藥物代謝動力學(xué)、藥物效應(yīng)動力學(xué)造成影響，甚至導(dǎo)致不良的安全后果。因此，對于ADA免疫原性評估在確定生物候選藥物的最終臨床成功方面非常重要。

因此，默克公司利用ProteinSimple公司的全自動Western Blot系統(tǒng)Wes（可以高靈敏度和高精度地定量靶蛋白的水平），開發(fā)了一種WESADA平臺，用于評價納米抗體（Nb）藥物開發(fā)過程中ADA的評估。

ProteinSimple公司Wes工作原理：

--研究內(nèi)容--

納米抗體X、Y、Z構(gòu)型

納米抗體X：由5個VHH組成：A，B，C，D和E。

納米抗體Y：由2個NHH組成：B和E。

納米抗體Z：由3個NHH組成：A，C和E。

A和B：兩種不同的抗鼠淋巴細(xì)胞激活基因3（LAG3）的VHH。

C和D：兩種不同的抗鼠編程性細(xì)胞死亡蛋白1（PD1）的VHH。

E：結(jié)合白蛋白的VHH，用于延長半衰期。

相同的35個氨基酸的GS-接頭連接所有VHH。 

納米抗體X滴度測定

為了確定固定在毛細(xì)管中的有效納米抗體濃度，以納米抗體X作為樣本，進(jìn)行2倍稀釋（從80降至1.25μg/mL）進(jìn)行上樣，以兩個ADA陽性樣品和抗納米抗體mAb1作為一抗，進(jìn)行檢測。最終選擇20μg/mL作為所有毛細(xì)管固定的納米抗體的默認(rèn)濃度。

WESADA更寬的動態(tài)信號范圍
 

將WESADA動態(tài)范圍與其他兩個常用的ADA分析平臺進(jìn)行了比較：1）MSD平臺2）Gyros。為了在所有三個平臺上進(jìn)行比較，要求最小的信噪比等于或高于10。如圖所示（▲：WESADA），WESADA平臺展示了更寬的動態(tài)范圍。

ADA信號滴定

WESADA信號用兩種ADA陽性樣品E和8的不同濃度進(jìn)行滴定。當(dāng)納米抗體濃度固定時，ADA陽性樣品E在5120倍稀釋因子時有信號，而樣品8在1280倍稀釋因子才有信號。表明小鼠樣品E的ADA滴度比樣品8高。

WESADA信號的特異性

為了確認(rèn)WESADA信號的特異性，將ADA陽性的小鼠樣品與500μg/mL天然納米抗體預(yù)孵育，再與納米抗體X反應(yīng)。結(jié)果顯示，所有ADA陽性小鼠血清樣品和陽性對照抗納米抗體mAb1的AUC均降低61％至100％。證明了ADA對天然納米抗體X的特異性。

WESADA同時對每個毛細(xì)管的多個目標(biāo)進(jìn)行ADA分析

為了測試WESADA同時進(jìn)行ADA分析的可行性，將NanobodyX（5個VHH模塊）單獨上樣，或者與NanobodyY（3個VHH模塊）共同上樣，跑膠后固化在毛細(xì)管上。再運行5種小鼠ADA陽性血清樣品作為一抗進(jìn)行檢測。如圖所示，WESADA可用于同一毛細(xì)管中固定多個納米抗體來檢測ADA。

多聚納米抗體的ADA特異性分析

利用WESADA檢測來確定哪些VHH模塊負(fù)責(zé)檢測到的ADA信號。給予納米抗體X（模塊A，B，C，D，E）的小鼠表現(xiàn)出很強(qiáng)的ADA反應(yīng)，而給予納米抗體Z（模塊A，C，E）的小鼠表現(xiàn)出相對較低的信號反應(yīng)。這表明模塊B或D可能是針對納米抗體X觀察到的ADA信號的原因。為了測試這種可能性，選擇5種針對納米抗體X的ADA信號最強(qiáng)的血清樣品（小鼠1，2，4，5，8，在圖中標(biāo)有*），對5種模塊進(jìn)行單獨檢測。結(jié)果顯示，五分之四樣品顯示模塊B的反應(yīng)較高，而對模塊A，C，D，E的信號則低至無法檢測到。這表明模塊B主要負(fù)責(zé)針對納米抗體X的ADA響應(yīng)。

結(jié)論：

蛋白類藥物的不良免疫反應(yīng)可能會對藥物的藥代動力學(xué)，功效和安全性產(chǎn)生不利影響。而抗藥物抗體（ADA）的存在已成為免疫原性應(yīng)答的關(guān)鍵決定因素。本文利用ProteinSimple的Wes系統(tǒng)建立了WESADA平臺�？梢詫�ADA的陽性樣品進(jìn)行鑒定，同時可以確定多價納米抗體構(gòu)建物中的哪個VHH模塊刺激了主要的ADA反應(yīng)。同時還允許對同一實驗樣品中具有不同分子大小的多個目標(biāo)同時進(jìn)行ADA分析。這種基于毛細(xì)管電泳的方法可對樣品進(jìn)行快速分析，而無需單獨定制優(yōu)化或試劑標(biāo)記，同時只需消耗少量樣品和藥物。因WESADA檢測到的任何ADA信號都可以與毛細(xì)管中藥物的預(yù)期分子量大小相關(guān)，從而排除了非特異性結(jié)合，提供了信號對藥物具有特異性的額外置信度。預(yù)示著WESADA平臺有助于在蛋白類藥物早期開發(fā)階段對大量實驗性候選藥物進(jìn)行便捷的免疫原性評估。