一支由耶魯大學(xué)YSM、哈佛醫(yī)學(xué)院BWH、蘇黎世大學(xué)IMCR和烏得勒支大學(xué)的科學(xué)家組成的國際團(tuán)隊(duì)共同合作，發(fā)現(xiàn)腸神經(jīng)系統(tǒng)分泌的IL-18介導(dǎo)粘膜免疫屏障。2020年1月9日，國際學(xué)術(shù)期刊《Cell》在線發(fā)表了這一成果^[1]。在此篇文獻(xiàn)研究中，使用了THUNDER Imager 3D live cell高分辨寬場系統(tǒng)。

《Cell》是與《Science》、《Nature》齊名的重要國際性刊物。《Cell》也是細(xì)胞生物學(xué)的最高期刊。2019最新的影響因子（Impact Factor）是 36.216。

腸道神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system， ENS）廣泛分布于腸道組織的每個(gè)角落，最新涌現(xiàn)的多個(gè)研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)ENS可以調(diào)控腸道組織的免疫作用^[2]。但是ENS怎么參與粘膜免疫的呢，媒介是什么，作用機(jī)制又是怎樣的此前還未有研究成果。如今，以耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Richard A. Flavell和哈佛醫(yī)學(xué)院布萊根婦女醫(yī)院Roni Nowarski為首的這支國際團(tuán)隊(duì)，研究并揭示了腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)如何參與維持腸粘膜免疫屏障。在沙門氏菌等致病菌的侵襲過程中，宿主細(xì)菌在腸道內(nèi)的防御是由ENS介導(dǎo)的。此研究使用了THUNDER系統(tǒng)進(jìn)行smFISH成像，統(tǒng)計(jì)了特定ENS細(xì)胞中的RNA單分子的數(shù)量，驗(yàn)證了IL18廣泛在小鼠結(jié)腸組織ENS中有表達(dá)^[1]。

此表明，THUNDER 不僅僅提供清晰銳利的圖像，統(tǒng)計(jì)意義上的量化分析結(jié)果也獲得了國際權(quán)威期刊的認(rèn)可。
  文獻(xiàn)賞析：
Enteric Nervous System-Derived IL-18 Orchestrates Mucosal Barrier Immunity
（腸神經(jīng)系統(tǒng)分泌的IL-18參與粘膜免疫屏障）
文章簡介：
粘膜免疫屏障是維持共生菌群和抵抗侵襲性細(xì)菌感染的必要條件。雖然過去普遍認(rèn)為協(xié)調(diào)維護(hù)這種腸道穩(wěn)態(tài)的是免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞，但在這篇新發(fā)表的文章中，作者證明腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)在其中也扮演著重要的角色。ENS產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子IL-18能誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗菌蛋白（AMP），抵抗腸道感染。
通過共聚焦顯微鏡單細(xì)胞成像和THUNDER的smFISH組織成像的結(jié)合，作者觀察到腸神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-18。值得注意的是，僅僅在腸神經(jīng)元中特異性敲除IL-18，可加劇小鼠的鼠傷寒沙門氏菌(S.t.)感染。說明源于腸神經(jīng)的IL-18對于抵抗腸道細(xì)菌感染是必須的；而特異性敲除免疫細(xì)胞或腸上皮細(xì)胞中的IL-18，不會(huì)影響小鼠對S.t.腸道感染的易感性。文章再結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)來探究ENS來源IL-18的功能以及作用方式。最終發(fā)現(xiàn)ENS特異性來源的IL-18能誘導(dǎo)結(jié)腸杯狀細(xì)胞增加表達(dá)抗菌蛋白AMP，從而抵抗致病菌的侵襲。說明腸神經(jīng)系統(tǒng)是抵御腸道致病菌的重要免疫介質(zhì)。

以下就是文中使用THUNDER Imager 3D live cell成像的smFISH圖像，驗(yàn)證了腸神經(jīng)系統(tǒng)ENS中的確廣泛存在IL18的表達(dá)。
  圖2E用smFISH檢測小鼠結(jié)腸組織中IL18 (紅色)、Tubb3(白色) 的表達(dá)；DAPI(藍(lán)色)表示細(xì)胞核。此圖可觀察到IL18 mRNA探針(紅色)與神經(jīng)元特異性Tubb3 mRNA探針(白色)的共定位。

實(shí)驗(yàn)方法：處死小鼠，取出結(jié)腸，用冷PBS沖洗。結(jié)腸組織縱向切開，鋪于濾紙上。用4% 多聚甲醛PBS溶液固定3 h；隨后用30% sucrose, 4% PFA PBS溶液4度過夜孵育。切成7mm厚度切片，并使用smFISH染色。設(shè)計(jì)的FISH探針庫與Cy5 (IL18)、TMR (Tubb3)連接，smFISH探針集雜交(Moor et al.,2018)。封片前再去除ENS內(nèi)的自發(fā)熒光信號。smFISH成像是在Leica THUNDER 3D Live Cell系統(tǒng)上進(jìn)行的，使用自帶的THUNDER Computational Clearing設(shè)置。

原文結(jié)論：在小鼠中使用Il18 mRNA探針進(jìn)行單分子熒光原位mRNA雜交（smFISH）。作者使用來自Il18 -/-小鼠的結(jié)腸切片驗(yàn)證了他們的Il18 mRNA探針的特異性。并觀察到Il18 mRNA探針和神經(jīng)元特異性Tubb3 mRNA探針有共定位（圖2E）�？傊�，這些數(shù)據(jù)表明腸神經(jīng)系統(tǒng)是結(jié)腸中IL-18的新型生產(chǎn)者。
  關(guān)于單分子熒光原位雜交(smFISH)技術(shù)：
全稱single-molecule fluorescence in situ mRNA hybridization (smFISH)，是研究單細(xì)胞基因表達(dá)能力的一種新的強(qiáng)有力的技術(shù), 因?yàn)樗�能夠檢測和計(jì)數(shù)單個(gè) RNA 分子。與深度測序方法互補(bǔ), smFISH 提供了有關(guān)轉(zhuǎn)錄豐度的細(xì)胞間變異和特定 RNA 亞單位定位的信息。^[3][4]

另外有smFISH相關(guān)文獻(xiàn)表示，為了收集smFISH探針發(fā)出的最大數(shù)量的光子，更建議使用寬場技術(shù)。共焦顯微鏡會(huì)顯著限制要收集的光的數(shù)量^[5]，而寬場技術(shù)會(huì)是對smFIGH成像更好的選擇。
當(dāng)然，這篇發(fā)表在《CELL》的文獻(xiàn)內(nèi)也大量使用了共聚焦技術(shù)對大鼠結(jié)腸神經(jīng)元進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞的免疫熒光成像。

綜上所述，此文章很好地結(jié)合了共聚焦成像和高分辨寬場技術(shù)。采用THUNDER高分辨寬場技術(shù)對smFISH探針進(jìn)行快速大面積結(jié)腸組織成像，在RNA角度檢測到IL18 與Tubb3 的共表達(dá)，驗(yàn)證了有IL18在小鼠結(jié)腸組織ENS的普遍的總體表達(dá)；再結(jié)合了共聚焦技術(shù)對大及小鼠結(jié)腸組織分離的肌間神經(jīng)叢的高倍成像，在蛋白的角度觀察到IL-18和Tubb3共同表達(dá)在單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)。最后兩種方法互相印證，得出了腸道神經(jīng)系統(tǒng)ENS能產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-18的結(jié)論。

這也是首次揭示了ENS能夠產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-18，抵抗致病菌的侵襲，維持腸黏膜免疫屏障。

THUNDER高分辨率快速的特點(diǎn)很好地滿足了小鼠結(jié)腸組織切片smFISH快速大視野掃描。不僅僅提供清晰銳利的圖像，由于成像速度快，能對組織進(jìn)行大面積高清掃描，故此能用于后期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。文章以THUNDER的smFISH成像為基礎(chǔ)，特定統(tǒng)計(jì)了ENS細(xì)胞中的RNA單分子的數(shù)量，驗(yàn)證了IL18廣泛在小鼠結(jié)腸組織ENS中有表達(dá)。

再加上此前的以下兩篇文章，THUNDER累計(jì)文章已達(dá)到三篇了。 2019-Molecular imaging of fibroblast activity after myocardial infarction using a 68Ga-labelled

2019年8月發(fā)表于《Journal of Nuclear Medicine》，IF 7.354，使用THUNDER Imager 3D Tissue型號。^[6]
  Left-right asymmetric heart jogging increases the robustness of dextral heart looping in zebrafish

2019年11月發(fā)表于《Developmental Biology》，IF 2.936，使用THUNDER Model Organism型號。^[7]


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參考文獻(xiàn)：
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[6] Zohreh V., Sarajo M.,3, Stephanie R., Miriam B., Yuanfang L., Negar O., Geoffrey T., Ting S., Stephan G. N., Antonia R., Christian W., Andreas H., Uwe A. H., Wolfgang A. W., Molecular imaging of fibroblast activity after myocardial infarction using a 68Ga-labelled fibroblast activation protein inhibitor FAPI-04, J Nucl Med.,10.2967, (2019).
 
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