蛋白質(zhì)磷酸化指由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸）上的過程，是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起重要作用。異常的磷酸化事件常與許多疾病狀態(tài)相關(guān)。

       在評估蛋白磷酸化時，可選擇的方法有很多，Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的最常用方法。磷酸化蛋白的檢測具有挑戰(zhàn)性，因此在實驗的各個階段都需要特別注意。Vilber為您提供幾條小妙招，助力您獲得更加滿意的實驗結(jié)果。

1.樣品處理：在穩(wěn)定的環(huán)境條件下細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成和分解處于動態(tài)平衡，當在體外從細胞和組織中提取蛋白時，細胞內(nèi)的蛋白酶和磷酸酶就會被釋放出來或被激活，導(dǎo)致目的蛋白分解或去修飾，因此需要在提取物中添加適當?shù)牡鞍酌浮⒘姿崦傅纫种苿�。選用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，并在使用前進行預(yù)冷，是防止樣品處理時蛋白降解和去修飾的有效方法。
2.選擇特異性的磷酸化抗體并檢測總蛋白的量：磷酸化抗體主要是針對磷酸化位點制備的是一種位點特異性的抗體。由于測得的磷酸化蛋白水平可能隨處理或凝膠上樣誤差而變化，所以需要用非磷酸化的抗體來檢測同源蛋白的總水平，以確定磷酸化組分相對于總組分的比例，并可充當上樣對照。例如：H2O2誘導(dǎo)NIH3T3細胞衰老和AMPK通路抑制。用H2O2處理細胞，在不含H2O2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-5天，可以通過AMPK的磷酸化水平，檢測到AMPK通路的受抑制情況。

Fig. 1 H2O2 induced senescence and AMPK pathway inhibition in NIH3T3 Cells. 

Xiaojuan Han et al., Aging Cell (2016) 15, pp416–427

3.封閉：做好封閉可以降低背景，提高檢測靈敏度。封閉時建議選擇BSA配合TBS緩沖液作為封閉液使用，不建議用脫脂牛奶作為封閉液，因為牛奶中的蛋白質(zhì)可能會干擾磷酸化蛋白的檢測�？墒覝胤忾]2小時或者4℃封閉過夜。封閉時膜與封閉液充分接觸，避免長時間離開封閉液。
4.洗膜：洗膜時要選用合適的洗滌液，選用TBST作為洗滌緩沖液，洗膜四次，每次10分鐘，在脫色搖床上進行，可以很好的去除膜上非特異性的結(jié)合，降低背景。而使用PBS時，緩沖液中的磷酸根，則會產(chǎn)生干擾靶蛋白的磷酸化信號。 Figure1. AtANN4 Regulates the Salt Stress Response in Aradidopsis through the SOS Pathway.   
Ma et al., 2019, Developmental Cell 48, 697-709

5.成像：完成了以上所有工作，到了最后檢驗實驗結(jié)果的關(guān)鍵步驟--成像。成像時，底物需要現(xiàn)配現(xiàn)用，配制時更要注意避光及兩種溶液的充分混合，注意實驗的每一個細節(jié)才是實驗立于不敗之地的王道。蛋白的磷酸化水平的變化是一些調(diào)控的主要方式，而這些差異變化往往是很細微的，需要精確的檢測才能準確的闡述這一調(diào)控過程。選擇一個靈敏的檢測設(shè)備，幫您完成最后的檢測工作。

 

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• - 多種像素整合方式，最高12x12的像素整合，極大的提高靈敏度，尤其適合蛋白的磷酸化檢測；

• - 多種成像模式，兼容化學(xué)發(fā)光和熒光成像，最多可以升級7通道的熒光成像。用戶可以輕松完成磷酸化蛋白等重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程或涉及多個蛋白的復(fù)雜調(diào)節(jié)過程；

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