研究背景
    乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)疾病，目前乳腺癌治療會(huì)結(jié)合手術(shù)和多種輔助治療手段。然而在乳腺癌治療中，化療藥物耐藥是治療一大障礙。因此深度理解藥物抵抗、代謝機(jī)制實(shí)施個(gè)性化藥物治療非常重要。吉西他濱(Gemcitabine; 20,20-difluorodeoxycytidine, dFdC)是FDA批準(zhǔn)的治療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病人以及蒽環(huán)霉素輔佐化療失敗病人的一線藥物。90%以上吉西他濱服用都是由胞苷脫氨酶將其轉(zhuǎn)化為2’-deoxy-2’,2’-difluorouridine (dFdU)導(dǎo)致失活。最近研究表明吉他西濱代謝通路中的基因與吉他西濱藥物抵抗相關(guān)。另外，有研究表明，miRNA在化療藥物抵抗過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。然而，乳腺癌中吉他西濱藥物抵抗?jié)撛诘姆肿訖C(jī)制尚未闡述清楚。該研究中miRNA芯片（Agilent Technology, Austin, TX）以及mRNA芯片（Affymetrix, Santa Clara, CA）服務(wù)由上海伯豪生物完成。

研究結(jié)果

1. 吉西他濱抗性細(xì)胞構(gòu)建及其性質(zhì)描述

   為了揭示吉西他濱在乳腺癌中抗藥性的分子進(jìn)化機(jī)制，研究者通過(guò)將MDA-231細(xì)胞系暴露于12個(gè)逐漸增加吉西他濱藥物濃度產(chǎn)生出了吉西他濱抗藥細(xì)胞系MDA-231-Germ。MDA-231-Germ 的IC50值比親代細(xì)胞系MDA-231高9倍。用吉西他濱治療時(shí)MDA-231-Germ克隆細(xì)胞數(shù)目也顯著高于MDA-231。為了研究吉西他濱抗性基因，分別對(duì)親代細(xì)胞以及耐藥性細(xì)胞用芯片技術(shù)獲得mRNA表達(dá)譜，并進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)激活的通路都與藥物代謝相關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明研究者已經(jīng)成功建立了吉西他濱抗性細(xì)胞系MDA-231-Gem cells。

2. 提高CDA表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥性

    基于以上mRNA表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)一些重要的吉西他濱代謝酶主要集中于一個(gè)代謝通路中。其中能夠通過(guò)脫氨基作用失活吉西他濱的CDA在MDA-231-Gem細(xì)胞中上調(diào)。此外，CDA在MDA-231和MDA-436表達(dá)，但是在MCF7, ZR-75-30 ,MDA-468, and Hs-578T細(xì)胞系中幾乎不表達(dá)。而與芯片分析結(jié)果一致，CDA在MDA-231-Germ與其他細(xì)胞系相比高表達(dá)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)CDA的乳腺癌細(xì)胞系具有更高的IC50值。抑制CDA表達(dá)能夠降低乳腺癌細(xì)胞系對(duì)吉西他濱的藥物抗性。以上結(jié)果表明CDA表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞系對(duì)于吉西他濱治療敏感性非常相關(guān)。

3. CDA抑制乳腺細(xì)胞增殖導(dǎo)致細(xì)胞循環(huán)重分配

   細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明CDA表達(dá)量高的MDA-231-Gem細(xì)胞比其親代細(xì)胞增殖速率慢。CDA過(guò)表達(dá)能夠抑制MDA-231和MCF-7細(xì)胞增殖，CDA抑制能夠促進(jìn)MDA-231細(xì)胞增殖。因此，可以得出結(jié)論CDA能夠抑制乳腺細(xì)胞增殖。由于CDA在嘧啶轉(zhuǎn)換為尿苷過(guò)程其重要調(diào)控作用，因此可能會(huì)影響核酸池平衡致使復(fù)制速率減慢。因此通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞比例在MDA-231-Gem中比親代細(xì)胞明顯增加。在MDA-231和MCF-7導(dǎo)入外源性CDA導(dǎo)致S期細(xì)胞比例增加。當(dāng)在MDA-231-Gem導(dǎo)入CDA靶向的shRNA，S期富集現(xiàn)象逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明CDA在調(diào)控細(xì)胞周期重分布以及復(fù)制過(guò)程發(fā)揮重要作用。

4. Cyclin E–CDK2復(fù)合物及其相關(guān)分子參與CDA介導(dǎo)的細(xì)胞周期重分布

   Cyclin E–CDK2在控制G1-S細(xì)胞周期中起到重要作用，因此本文用Western blot實(shí)驗(yàn)分析cyclin E–CDK2 complex，當(dāng)CDA在MDA-231-Germ中高表達(dá)時(shí)cyclin E和CDK2下調(diào)。而沉默CDA，cyclin E–CDK2復(fù)合物表達(dá)增加。與cyclin E類似cyclin A表達(dá)也與CDA呈相反趨勢(shì)。cyclin E–CDK2復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致Rb磷酸化不能與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合使下游基因轉(zhuǎn)錄度過(guò)G1-S期。磷酸化Rb，Rb表達(dá)以及E2F表達(dá)與cyclin E–CDK2復(fù)合物類似說(shuō)明CDA水平可能會(huì)降低cyclin E–CDK2復(fù)合物表達(dá)抑制下游通路活性。以上結(jié)果說(shuō)明cyclin E–CDK2復(fù)合物以及其相關(guān)的分子參與了CDA誘導(dǎo)的細(xì)胞周期重分布。

5. miR484作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控子下調(diào)CDA表達(dá)

   首先本研究采用多種算法預(yù)測(cè)CDA的靶基因，得到34個(gè)候選miRNA至少被四個(gè)算法預(yù)測(cè)到。34個(gè)候選miRNA中有3個(gè)在MDA-231-Gem和親代細(xì)胞差異表達(dá)。熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)證實(shí)三個(gè)miRNA可以和CDA結(jié)合。western blot發(fā)現(xiàn)miR-484能有效抑制CDA表達(dá)。3個(gè)miRNA中只有miR-484與CDA表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明miR-484可能通過(guò)直接靶向CDA 3’-UTR使其表達(dá)下調(diào)。

6. miR-484/CDA調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞吉西他濱抗性、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞周期重分布

   以上結(jié)果表明CDA可能是miR-484靶基因，為了進(jìn)一步驗(yàn)證，過(guò)表達(dá)miR-484能夠引起CDA表達(dá)下降，其所表現(xiàn)出的結(jié)果和引入shRNA類似。進(jìn)一步，如果CDA是miR-484靶基因，那么在miR-484表達(dá)的細(xì)胞中引入CDA應(yīng)該可以抵消miR-484引起的表型。結(jié)果正如預(yù)料的一樣，說(shuō)明miR-484能夠靶向CDA調(diào)控下游通路。

7. CDA表達(dá)可作為乳腺癌預(yù)后marker

   qPCR對(duì)30對(duì)樣本檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性乳腺癌比其配對(duì)癌旁中CDA表達(dá)頻繁顯著下調(diào)，而miR-484剛好相反。對(duì)193原發(fā)乳腺癌樣本和36非癌control用IHC檢測(cè)CDA蛋白水平發(fā)現(xiàn)CDA在94.4%非癌組織中有很強(qiáng)的信號(hào)，而在原發(fā)腫瘤中比例有所降低（40%）。此外，臨床特征分析表明CDA與乳腺癌ER狀態(tài)強(qiáng)烈相關(guān)。KM分析表明高CDA表達(dá)與長(zhǎng)的DFS（disease-free survival）顯著相關(guān)。此外，CDA高表達(dá)使乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低。以上結(jié)果表明CDA表達(dá)水平可以作為乳腺癌的預(yù)后marker。

研究結(jié)論

   本研究闡述了乳腺癌吉西他濱抗藥性的分子機(jī)制以及乳腺癌細(xì)胞中miR-484/CDA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。闡述了miR-484調(diào)控CDA在調(diào)節(jié)吉西他濱抗性和細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖中的重要作用，且CDA可以作為乳腺癌預(yù)后的marker。

原文出處
Fu-Gui Ye,Chuan-Gui Song, Zhi-Gang Cao,Chen Xia, Dan-Na Chen, Li Chen, ShanLi, Feng Qiao, Hong Ling, Ling Yao, Xin Hu, and Zhi-Ming Shao. Cytidine Deaminase Axis Modulated by miR-484 Differentially Regulates Cell Proliferation and Chemoresistance in Breast Cancer. Cancer research 2015, 75, 1504-15.