來自蒙特利爾麥吉爾大學（McGill University）和魁北克基因創(chuàng)新中心（Génome Québec Innovation Centre ,MUGQIC）的JiannisRagoussis博士是乳腺癌研究領域最早實現(xiàn)單細胞全外顯子組測序的科學家之一。長久以來，希臘人都以開拓者的形象聞名于世，Ragoussis博士也不例外，早在2013年他加入魁北克基因創(chuàng)新中心（MUGQIC）之前，就已經在牛津大學的人類遺傳學威康信托中心（Wellcome Trust Centre for Human Genetics）做了11年研究，將已有的基因組學平臺發(fā)展成果與新引進的二代測序技術進行了有機結合。

 

 

在魁北克基因創(chuàng)新中心，Ragoussis博士率先采用Fluidigm的 C1系統(tǒng)制備單細胞全外顯子組測序樣本使二代測序達到了單個細胞測序的分辨率。他開創(chuàng)性地根據細胞多樣性進行分類將癌癥的識別和消滅工作分成兩個項目進行，并且從最變幻莫測的乳腺癌開始研究。他的研究小組主要研究三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer），這是惡性程度最高的乳腺癌亞型之一，主要特點是預后很容易轉移和復發(fā)。由于缺乏表達雌激素、黃體酮和人表皮生長因子-2（HER2/neu）的受體，三陰性乳腺癌對標準的激素療法不敏感。傳統(tǒng)治療方法都只能針對這些受體中的一種進行治療，所以三陰性乳腺癌的病例往往頗具挑戰(zhàn)性。

 

單細胞全外顯子組測序技術提供了一個獨特的視角來進行癌細胞生物學研究，這是細胞群體樣本測序方法無法提供的。利用這一獨特的視角，Ragoussis博士得以在癌癥發(fā)生以及進行治療的過程中對個體細胞群的突變譜（mutational profiles）進行描述，并且可以追蹤它們隨時間是如何變化的。

 

單細胞全外顯子組測序技術對于攻克難治性（treatment-resistant）三陰性乳腺癌來說非常重要，Ragoussis博士說：“突變譜分析可以提供那些在治療后積累并促使癌細胞存活下來的變異信息�！�

 

 

在早期使用C1系統(tǒng)新流程的的一次實驗中，Ragoussis博士采用單細胞全外顯子組測序技術來檢驗個體細胞群的異質性。他解釋了項目進行到此階段的兩個整體的目標，“通過增加新的有意義的藥物靶標來擴充可能的藥物化合物庫，同時最大限度利用目前已有的化合物�！�

 

Ragoussis博士的研究小組首先致力于將細胞們按照各自的突變譜進行分組，這樣可以幫助他們確認究竟存在多少種不同類別的突變譜以及評價是否可以將突變基因歸類到可提供致瘤線索的相關的網絡中。他補充說“先理解腫瘤細胞的異質性以及腫瘤細胞在體外如何應答對于預測什么物質可能在體內有效是十分重要的。”

 

在近期的一項預試驗中，Ragoussis博士和同事們驗證了這個工作流程并且確認C1系統(tǒng)可以整合到他們已有的快速捕獲實驗流程中。Ragoussis博士說：“Fluidigm的工作流程是迄今我們應用的最令人振奮的技術成果之一。預試驗證明了這種方法在我們研究中的高效性和可行性�！�

 

采用新的工作流程產生了可靠的統(tǒng)計數據，Ragoussis博士估計大約覆蓋了70% 細胞的全外顯子組。他的結論是：“這些數據與傳統(tǒng)的細胞群體測序法所產生的數據是有可比性的�！�

 

Ragoussis博士是與麥克吉爾大學Goodman癌癥研究中心（Goodman Cancer Research Centre）的主管Morag Park一起合作研究的。Morag Park的實驗室通過外科手術創(chuàng)造出不同物種間組織移植的樣本，或者是在小鼠體內產生原發(fā)性乳腺癌的異種移植物。移植后這些癌細胞繼續(xù)保持原始腫瘤的復雜性進行生長。

 

在用培養(yǎng)基培養(yǎng)異種移植物細胞后，研究小組利用C1系統(tǒng)進行單細胞捕獲從而對全外顯子組進行測序。迄今為止，科研人員們已經對來自一個難治性腫瘤中的81個單細胞進行了分類。

 

目前Ragoussis博士和他的研究小組已經識別出腫瘤中所有的體細胞突變，他們正利用這些信息來定義錯誤發(fā)生率（false discovery rate）以及確定一個特殊的突變在被界定成為真正具有統(tǒng)計學意義的發(fā)現(xiàn)時需要被檢測到的次數。

 

接下來，科研人員們計劃利用單細胞外顯子組測序技術來闡明難治性產生的機制。Ragoussis博士希望結合單細胞全外顯子組測序的數據和已有的蛋白表達數據集創(chuàng)建出能夠分析體外治療效果的試驗方法。從理論上來說這種方法可以幫助我們找到針對不同癌細胞類型患者的行之有效的個性化治療方案。

 

 

第二個項目由Ragoussis博士與麥吉爾大學的Richard Kremer來合作完成。在此項目中Ragoussis博士檢測了血液循環(huán)中腫瘤細胞分子層面的信息。與腫瘤檢查一樣，這種被稱為“液態(tài)的活體組織切片”中也充滿了各式各樣的癌細胞，通過它可以實時地評估患者當下的病情，而且評估結果比影像學方法更加精確，與傳統(tǒng)的活體組織切片法相比也是一種微創(chuàng)的方法。由于血液樣本容易獲得，我們就可以在治療前后對腫瘤細胞的情況都進行監(jiān)控。“這可以幫助我們預測轉移行為，也可以使我們看到一種治療方案能否消滅某個特別危險的細胞群，” Ragoussis博士解釋道，“我們最終的目標是實現(xiàn)個體化用藥，到那個時候患有難治性癌癥的病人能夠通過循環(huán)腫瘤細胞分析找到最能抵御疾病的特殊藥物�！�

 

Ragoussis博士說：“盡管目前仍處于研究早期，但是我們可以很清晰的看到單細胞的分辨率比細胞群體實驗所顯現(xiàn)出的結果涵蓋了范圍更廣的發(fā)散度，使我們看得更加精細。如果我們想闡明細胞的轉錄編程機制，全外顯子組測序將成為突變分析的必要條件之一。

 

Ragoussis博士和他的同事們正在籌劃組織來自MUGQIC 的250名研究人員融合新的基因組學方法和生物信息學開發(fā)可以廣泛應用于醫(yī)療領域的新技術。

 

他說：“我們的使命就是建立基因組學研究方法并使它們得到廣泛應用。這些相似的單細胞測序方法幾乎可以為我們研究所有疾病提供啟示�！�