Life Technologies旗下Ion Torrent推出外顯子組捕獲試劑，該試劑采用了AmpliSeq技術，將工作流程時間減至6小時（含1小時手控時間），并能進行50毫微克的樣本輸入。

作為早期使用用戶，Selah Genomics基因組服務部副總裁Jeremy Stuart告訴《測序》期刊，其仍在對試劑的數(shù)據質量進行評估，經過初檢，該試劑“表現(xiàn)符合預期”。 從工作流程來看，該試劑“操作簡單、使用方便”。

Stuart補充說，采用其他外顯子組捕獲試劑需要2至3天才能制作出文庫，而使用該試劑，Selah的研究人員能在一天之內就制作出文庫。“毫無疑問，該試劑更快捷、更省力”， Stuart說。

Stuart表示，下一步是將AmpliSeq外顯子組捕獲試劑與混合使用的試劑,如Agilent（安捷倫）的SureSelect試劑或HaloPlex試劑以及, Life Tech將后續(xù)提供的，用于Ion的TargetSeq外顯子組捕獲試劑進行比較。

Life Tech不是唯一一家力圖解決周轉時間和限制外顯子組捕獲樣本輸入等問題的公司。Agilent（安捷倫）和Illumina均分別研發(fā)出試劑，以解決上述問題。使用Agilent（安捷倫）HaloPlex試劑的用戶報告說，該試劑需要3天的周轉時間，是使用SureSelect試劑時間的一半，最初可以輸入200毫微克樣本（IS 3/19/2013）。 同時，Illumina聲稱其Nextera Rapid Capture Exome試劑能夠在1.5天內對96個樣本進行樣本制備和外顯子組富集捕獲，以及進行50毫微克DNA輸入。

AmpliSeq Exome試劑含有300,000個擴增子，可以復用到12個具有24,000個擴增子的擴增子池。 這12個擴增子池分別進行單獨的PCR反應，隨后組合成單一反應，此時，也進行標準的AmpliSeq反應，Life Tech產品營銷部高級主管Andy Felton告訴IS。

在研制外顯子組試劑時，主要的技術障礙是在保持均勻覆蓋的同時復用24,000個擴增子，F(xiàn)elton補充說。我們尚不需要對AmpliSeq文庫制備做重大改變，公司僅需對文庫制備的One Touch II機器進行優(yōu)化，并稍微改進部分生物學信息，以確保能對變異進行準確分析，F(xiàn)elton解釋說。

保持均勻覆蓋的一項關鍵之處在于確保緊挨的擴增子處于不同的擴增子池中，F(xiàn)elton說，“當我們繪制特定基因時，我們希望獲得最佳的覆蓋率，因此，必須將彼此緊挨的擴增子分離至單獨的擴增子池”。 這與公司在其他AmpliSeq面板中使用的原理相同，但是，“由于達成24,000-個擴增子叢和300,000對擴增子引物，這使AmpliSeq Exome試劑更上一層樓”，F(xiàn)elton補充說。

12個擴增子池分別進行單獨的PCR反應，隨后匯集在同一池中。

Felton解釋說，如果用戶在Ion Proton PI芯片上運行兩個外顯子組，各反應的試劑成本約750美元，包括外顯子組捕獲、文庫試劑、模板試劑、測序試劑和芯片。如果用戶購買了進行48個反應的試劑，則各反應將花費400美元左右。

Felton說，當在PI芯片上運行單個外顯子組時，該試劑可以以10倍的速度覆蓋98%的文庫，以及以20倍的速度覆蓋96%的文庫。 此外，0.2倍平均覆蓋率范圍內的文庫覆蓋率高達90%。

對于在一個芯片上運行兩個外顯子組的用戶而言，該試劑可以以10倍的速度覆蓋98%的文庫，以及以20倍的速度覆蓋94%的文庫。如運行三個外顯子組，則該試劑可以以10倍的速度覆蓋94%的文庫，以及以20倍的速度覆蓋88%的文庫。

這便于用戶在孟德爾研究中在單個PI芯片上運行三個外顯子組，或者運行一個外顯子組以獲得更高的覆蓋率，F(xiàn)elton解釋說。

從DNA到外顯子組注釋變異的整個工作流程可以在兩天內完成，其中，外顯子組文庫制備需6個小時，測序時間為3小時，F(xiàn)elton補充說。

Selah Genomics的Stuart表示，截至目前，公司已采用該試劑制作了8個外顯子組文庫。 盡管其尚未完成數(shù)據分析，到目前為止，覆蓋情況良好，目標區(qū)域的覆蓋率高達90%。 此外，“以20倍或更高倍的速度進行覆蓋，覆蓋率也在90%的范圍內”， Stuart說，其目前正在外顯子組數(shù)據中尋找一種適合的質量指標。

Stuart表示，該試劑操作簡單、方便快捷，非常具有吸引力。

“如涉及我們希望開展的外顯子組測序數(shù)量，限制因素之一通常在于工作流程和費用”， Stuart補充說，“就工作流程而言，[采用AmpliSeq Exome試劑]，目前我們已可以開始處理大量樣本”。

由于Selah Genomics的研究人員已經有過使用其他Ion AmpliSeq面板的經驗，因此，轉為采用AmpliSeq Exome時并無困難，Stuart說。

與采用混合試劑進行外顯子組測序的方法相比，擴增子法的一個優(yōu)勢體現(xiàn)在輸入數(shù)量很小，約100毫微克，Stuart說。 此外，擴增子法僅需進行一次擴增——盡管Ion提供了進行二次擴增的機會——而混合法卻需要進行兩次擴增。

Stuart表示，其將把AmpliSeq Exome試劑主要用于腫瘤應用中。最初，Stuart將該試劑用于尋找胚系突變。但是，最終其對在同一芯片上運行腫瘤和正常外顯子組以尋找罕見的體細胞突變倍感興趣。

Stuart說，在推出AmpliSeq Exome試劑后，其計劃將AmpliSeq Exome試劑與Proton PII芯片結合使用，這將“為同時運行腫瘤和正常外顯子組以及檢測罕見的體細胞突變提供了契機”。

除Ion Proton外，Selah Genomics還運行了Ion Torrent PGM、Illumina的MiSeq、454 GS FLX和 Pacific Bioscience的RS。

Stuart表示，Selah Genomics主要關注腫瘤學和病毒學。Selah Genomics使用Proton運行AmpliSeq的綜合癌癥面板，并根據AmpliSeq的熱點面板發(fā)起一項名為“PrecisionPath”的實驗室開發(fā)測試。 公司已與南卡羅來納州的格林維爾醫(yī)療系統(tǒng)公司（Greenville Health System）開展合作，以向癌癥患者提供該項測試(CSN 5/8/2013)。

此外，Selah還通過使用PGM和MiSeq進行伴隨試驗，為制藥公司的臨床試驗提供支持，Stuart補充說。

Stuart表示，實驗室自5月起購入Proton，每次運行通常產生8到11千兆堿基，基本與其他用戶報告的數(shù)量相等（IS 2/26/2013）。 當一次運行兩個外顯子組文庫時，以20倍或更高倍速度對目標區(qū)域進行的覆蓋，覆蓋率可高達近90%，Stuart說，“這使得我們能一次運行一對外顯子組，胚系突變也得到充分覆蓋”。