蛋白免疫印跡雜交（Western Blot WB）是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜（blot）上，然后通過一抗/二抗復(fù)合物對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法。其中的步驟包括蛋白樣本提取制備，蛋白定量，電泳，轉(zhuǎn)膜與顯色。

     凱基公司根據(jù)客戶的需求最新推出凱基蛋白提取和SDS PAGE凝膠電泳試劑盒（KGP113）和凱基western blotting 檢測(cè)試劑盒說明書(KGP1201和KGP1202)兩個(gè)western檢測(cè)的組裝試劑盒，只要客戶自己準(zhǔn)備好樣本、一抗和顯影等試劑，就可輕松完成整個(gè)western的操作流程，再也不用操心western過程中某種試劑的缺失問題。

 

    

    下圖就是采用KGP113和KGP1201試劑盒檢測(cè)一個(gè)藥物的干預(yù)后細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)量。

     凱基的蛋白提取試劑盒包括了所需的提取buffer和各種蛋白酶抑制劑以外，如EDTA、EGTA、Sodium orthovanadate、Sodium fluoride、Leupeptin、Pepstatin A、Aprotinin和PMSF，還包括新型的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，如E-64 Protease、Cantharidin和α-phenauthrolire，可以更有效地抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用，使客戶提取的蛋白無降解的后顧之憂。Lysis buffer中還含有兩性的表面活性劑，如Zwittergent，能很大程度提高蛋白提取的效率。全蛋白抽提試劑盒獲得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后續(xù)研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究。核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒可同時(shí)獲得樣本的核蛋白和胞漿蛋白，提取的蛋白可用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄因子活性分析、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting。膜蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒可同時(shí)獲得樣本的膜蛋白和胞漿蛋白，其中的膜蛋白包括不僅含細(xì)胞膜蛋白，也含胞器質(zhì)膜蛋白，可用于PAGE電泳、 Western Blot、免疫共沉淀等后續(xù)研究。

     除了上述的細(xì)胞和組織樣品的蛋白提取，凱基公司還推出了細(xì)菌、酵母、植物蛋白抽提試劑盒和細(xì)胞亞組份蛋白抽提試劑盒。

 

     KeyGEN公司在原有的蛋白提取試劑盒的基礎(chǔ)之上，最新推出操作更簡(jiǎn)便和性價(jià)比更高的蛋白提取的各種裂解液。

     裂解液包括蛋白提取的所有組份，其中包括絕大部分的蛋白抑制劑，如： EDTA、EGTA、Sodium orthovanadate、Sodium fluoride、Leupeptin、Pepstatin A和Aprotinin，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

 

      凱基的蛋白定量試劑盒包括Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒和Lowry法蛋白

含量檢測(cè)試劑盒三個(gè)系列，使客戶在電泳前做到心中有數(shù)。根據(jù)組織細(xì)胞裂解或勻漿所使用的方法及裂解液的不同選用，因?yàn)槿ス竸┖瓦�原劑等對(duì)不同蛋白濃度測(cè)定方法的影響差別很大。如使用凱基公司生產(chǎn)的蛋白提取試劑盒或者裂解液，建議使用凱基BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

     凱基公司為您準(zhǔn)備了所有電泳的試劑，包括上樣buffer，SDS-PAGE配膠試劑盒，電泳buffer、蛋白

Marker和蛋白染色試劑盒。

第一步：根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度進(jìn)行凝膠的配制，可以使用凱基SDS-PAGE凝膠配制試劑盒

第二步：進(jìn)行蛋白變性，樣品先置95℃的水浴加熱5分鐘，接著置冰浴中5分鐘，10000g離心20分鐘，取上清液（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）。蛋白上樣緩沖液可以使用凱基SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)

第三步依次加入預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)和待分析樣品。（加樣時(shí)間要盡量短，以

免樣品擴(kuò)散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應(yīng)。樣品一般在0.75mm厚的膠 加樣30-50ug/lane)。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，如凱基預(yù)染蛋白分子量 Marker和預(yù)染彩色蛋白分子量 Marker。

   第四步：電泳。加樣完畢，選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳。電泳時(shí)通常在濃縮膠時(shí)使用低

電壓恒壓電泳（40V/cm），而在溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳（80V、cm）。電

泳直至溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。

電泳結(jié)束后，需進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，一抗的孵育和洗滌，二抗的孵育和洗滌，最后進(jìn)行顯色。

1、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜可以采用PVDF膜。轉(zhuǎn)膜電泳緩沖液可以使用凱基電轉(zhuǎn)移緩沖液(10×)。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。

轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的WB洗滌液中，漂洗1～2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。用巴斯特吸管吸盡洗滌液，加入WB封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60分鐘或4℃ 封閉過夜。

3、一抗孵育

參考一抗的說明書，按比例用WB一抗稀釋液適當(dāng)稀釋一抗。用巴斯特吸管吸盡封閉液，不要漂洗，直接加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果效果不佳，可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜。加入WB洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5～10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，漂洗3～5次，每次5～10分鐘。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長(zhǎng)漂洗時(shí)間并增加漂洗次數(shù)。

4、參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用WB二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。用巴斯特吸管吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。加入WB洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5～10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，漂洗3～5次，每次5～10分鐘。如果顯色結(jié)果背景較高，可以適當(dāng)延長(zhǎng)洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。

5、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，可以采用凱基 ECL 檢測(cè)試劑盒

 

 

凱基公司向客戶提供常用的內(nèi)參一抗和常用二抗。

 

同時(shí)凱基公司還提供各種磷酸化和非磷酸化一抗，具體請(qǐng)?jiān)斠姽�司網(wǎng)址：http://www.keygentec.com.cn/