根據(jù)中國(guó)有關(guān)用戶的要求，美國(guó)宇航局生命技術(shù)中心的Roger Akers將在北京作三維微重力旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞組織培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS生物反應(yīng)器）應(yīng)用情況的報(bào)告，歡迎大家報(bào)名。報(bào)名方式：info@EQUL.com

曰期 : 2001年10月30日
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會(huì)議主題：三維微重力旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)的最新進(jìn)展

體內(nèi)組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程是在一定的內(nèi)環(huán)境條件下進(jìn)行的，常規(guī)的體外單層培養(yǎng)方法不能提供組織正常生長(zhǎng)發(fā)育所需的環(huán)境條件，通常的后果是細(xì)胞發(fā)生分化現(xiàn)象，培養(yǎng)的細(xì)胞不僅失去了正常的形態(tài)，而且失去了其生化與功能性質(zhì)。比如，軟骨細(xì)胞在單層培養(yǎng)過(guò)程中，呈現(xiàn)出類似成纖維細(xì)胞的形態(tài)，并且由正常條件下的分泌Ⅰ型膠原轉(zhuǎn)變到分泌Ⅱ型膠原，這一形態(tài)與功能變化與培養(yǎng)條件有關(guān)［12］。因而需要通過(guò)培養(yǎng)系統(tǒng)技術(shù)對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行有效的控制。培養(yǎng)系統(tǒng)能提供以下基本性能：
(1)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行有效的、均一的混合并對(duì)傳質(zhì)過(guò)程進(jìn)行精確控制；
(2)調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器中的剪應(yīng)力大�。�
(3)維持恒定的pH值、氣體分壓及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度；
(4)通過(guò)過(guò)程控制以滿足培養(yǎng)物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)環(huán)境條件的不同需求。然而，不同于普通的用于大規(guī)模生產(chǎn)基因工程產(chǎn)物的反應(yīng)器(容積可高達(dá)105升)，用于組織工程的培養(yǎng)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)原則是通過(guò)模擬在體的內(nèi)環(huán)境條件，提供工程組織生長(zhǎng)發(fā)育所需的必要的生化條件，以及針針不同的組織提供細(xì)胞分化所需的特殊條件(容積一般不大于0.5升)。實(shí)現(xiàn)這一目的除了要求提供足夠大的傳質(zhì)速率以保證細(xì)胞的生長(zhǎng)外，還需要根據(jù)所培養(yǎng)的組織類型，在反應(yīng)器的設(shè)計(jì)上模擬組織生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境狀態(tài)，促進(jìn)不同細(xì)胞的分化。

與單層培養(yǎng)相比，三維組織培養(yǎng)通常含有很高的細(xì)胞密度，因而需要頻繁地?fù)Q液以保持營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，因此，在培養(yǎng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)中，通常采用灌注培養(yǎng)方式來(lái)維持pH值和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的穩(wěn)定，這種培養(yǎng)方式也避免了在對(duì)工程組織的長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中，由于換液操作而帶來(lái)的污染風(fēng)險(xiǎn)［13］。

高密度細(xì)胞培養(yǎng)常常受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)不充分的限制，為了滿足培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)高傳質(zhì)速率的需要，對(duì)培養(yǎng)槽需要進(jìn)行特殊的設(shè)計(jì)。早期的工作曾應(yīng)用機(jī)械攪拌等方式，對(duì)貼附在微載體上的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)來(lái)維持足夠的傳質(zhì)效率。雖然通過(guò)對(duì)攪拌槳形狀的正確設(shè)計(jì)，添加保護(hù)劑等措施可以降低由攪拌引起的強(qiáng)剪應(yīng)力對(duì)細(xì)胞造成的損傷，因而可用于生物制藥的目的。然而這種混合方式除了產(chǎn)生了強(qiáng)剪應(yīng)力外，還造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與pH值的梯度，這種生化環(huán)境條件對(duì)組織的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生不利的影響，因而不適用于工程組織的培養(yǎng)。

如何有效地控制反應(yīng)器中的傳質(zhì)過(guò)程是組織工程用培養(yǎng)系統(tǒng)的技術(shù)難點(diǎn)。利用二次流是解決問(wèn)題的一個(gè)途徑，通過(guò)增加內(nèi)部流體的循環(huán)，傳質(zhì)速率大大提高。而由美國(guó)宇航局設(shè)計(jì)的旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)儀（www.EQUL.com)，具有不同的混合方式［14］。通過(guò)外部的旋轉(zhuǎn)方式，在低剪應(yīng)力的條件下，旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的流動(dòng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)成分充分的混合，并使一定大小之內(nèi)的培養(yǎng)物以懸浮狀態(tài)存在。在這種培養(yǎng)條件下，人肺腺癌細(xì)胞可與微載體形成0.2～0.5 cm的聚集體并具有顯著的分化特性［15］。這一技術(shù)已應(yīng)用于人工軟骨等多種組織的三維培養(yǎng)［16］。

References:

［11］Freed LE, Vunjak-Novakovic G, Langer R. Cultivation of cell-polymer cartilage implants in bioreactors. J cell Biochem, 1993; 51(3)∶257
［12］Aulthouse Al, Beck M, Griffey E et al. Expression of the human chondrocyte phenotype in vitro. In Vitro Cell Dev Biol, 1989; 25(7)∶659
［13］Sittinger M, Schultz O, Keyszer G et al. Artificial tissues in perfusion culture. Int J Artif Organs, 1997; 20(1)∶57
［14］Tsao YD, Goodwin TJ, Wolf DA et al. Responses of gravity level variations on the NASA/JSC bioreactor system. Physiologist, 1992; 35(1Suppl)∶S49
［15］Goodwin TJ, Jessup JM, Wolf DA. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol, 1992; 28A(1)∶47
［16］Freed LE, Hollander AP, Martin I et al. Chondrogenesis in a cell-polymer bioreactor system. Exp Cell Res, 1998; 240(1)∶58


[1] 大量培養(yǎng)細(xì)胞的意義：

動(dòng)物和人的細(xì)胞可以合成有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)（例如干擾素、單克隆抗體等等），在科研、臨床和商業(yè)上都有重大價(jià)值。要制備干擾素、單抗、尿激酶等，就需要大量培養(yǎng)哺乳動(dòng)物的細(xì)胞、人的雜交瘤骨髓瘤細(xì)胞、人的腎細(xì)胞等等。雖然工業(yè)微生物技術(shù)已發(fā)展很完善，但是它主要是用于培養(yǎng)細(xì)菌類的細(xì)胞，它們有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求較簡(jiǎn)單。而哺乳類細(xì)胞則大而脆弱，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求高，不能游離生活，大多數(shù)要附著在某種表面才能生長(zhǎng)。要大量培養(yǎng)哺乳類細(xì)胞是個(gè)困難的任務(wù)。

[2] 大量培養(yǎng)細(xì)胞的方法：

小的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，瓶底面積很小，只能培養(yǎng)很少細(xì)胞，要不斷分瓶，得用許多長(zhǎng)的瓶子不斷滾動(dòng)來(lái)獲得較多的細(xì)胞。后來(lái)，人們又采取高密度培養(yǎng)方法，以求在一定的容積內(nèi)能培養(yǎng)更多的細(xì)胞。對(duì)于要求附著生長(zhǎng)的細(xì)胞，為提高表面積/ 體積的比值，用空心纖維和微載體作為附著物，可以大大提高培養(yǎng)容積的利用率。
微珠作為載體，是提高培養(yǎng)密度的有效方法，細(xì)胞可以生長(zhǎng)在微珠的表面，微載體法，可使在同樣容積內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)增加幾個(gè)量級(jí)。隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，附近的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，廢物逐漸增多，為了使生長(zhǎng)的細(xì)胞不斷接觸到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并離開廢物，微珠能在培養(yǎng)介質(zhì)中分散和懸浮，并且不斷供應(yīng)培養(yǎng)液，不斷排出廢液。

[3] 綜述：

一項(xiàng)拯救生命的技術(shù)
用于培養(yǎng)組織和器官的技術(shù)
用于替代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的組織的技術(shù)

----- 細(xì)胞組織 在微重力環(huán)境下進(jìn)行的 三維的高分化度培養(yǎng)技術(shù)

I. 【該項(xiàng)拯救生命的技術(shù)的意義】
0.重組蛋白制藥: 效率是其它培養(yǎng)方法的10倍。
1.在軟骨再生中：RCCS培養(yǎng)出來(lái)的軟骨密度很高，可以用在損傷和關(guān)節(jié)炎的治療中。
2.在疫苗生產(chǎn)中：目前的丙肝疫苗效果不佳的部分原因是用來(lái)產(chǎn)生這種疫苗的病毒不是長(zhǎng)在人的肝臟中，而RCCS培養(yǎng)出來(lái)的肝臟在病理學(xué)家的看來(lái)和正常人的肝臟沒(méi)有什么區(qū)別，使得產(chǎn)生肝炎疫苗的病毒生長(zhǎng)在人的肝臟成為現(xiàn)實(shí)。在美國(guó)這項(xiàng)技術(shù)已廣泛用于生產(chǎn)。
3.在激素、酶和其它只有由人體組織產(chǎn)生的蛋白以及基因工程的研究和生產(chǎn)中：我們現(xiàn)在可在實(shí)驗(yàn)室或工廠中生產(chǎn)分化的人體組織，其被刺激后能分泌治療用的蛋白。例如，經(jīng)培養(yǎng)的神經(jīng)組織產(chǎn)生的神經(jīng)生長(zhǎng)激素將使脊椎的損傷得到修復(fù)。
4.在骨髓再生中：在RCCS中，骨髓生長(zhǎng)情況極佳，且可連續(xù)進(jìn)行增生和低溫冷凍保藏。這意味著在技術(shù)上建立全國(guó)性骨髓庫(kù)已經(jīng)成為可能。每個(gè)急性外傷中心的死亡事件都能產(chǎn)生一個(gè)潛在的骨髓捐贈(zèng)者，每年的這種事件無(wú)數(shù)就使得幾千種類型骨髓可以得到生長(zhǎng)和冷凍，從而建立全國(guó)性的骨髓庫(kù)。
5.在使糖尿病人不必長(zhǎng)期注射胰島素的工作中：產(chǎn)生胰腺細(xì)胞的胰島素培養(yǎng)后能插入糖尿病人體內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)。這樣，無(wú)數(shù)的病人有望免去長(zhǎng)期注射胰島素的煩惱。
6.在腫瘤的研究和治療中：
A. 有效地殺滅腫瘤：RCCS中培養(yǎng)后，感化了的淋巴細(xì)胞能徹底殺滅腫瘤組織。例如，對(duì)于膀胱癌病人，醫(yī)生對(duì)病人的腫瘤組織進(jìn)行活體取樣，與其自身免疫系統(tǒng)的白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞在RCCS中進(jìn)行混合培養(yǎng)，刺激或訓(xùn)練這些免疫系統(tǒng)的細(xì)胞來(lái)識(shí)別和攻擊腫瘤組織，然后把這些經(jīng)訓(xùn)練后有殺傷力的細(xì)胞直接注入病人的腫瘤組織中。這樣，這些經(jīng)感化的淋巴細(xì)胞徹底殺滅了腫瘤。
B. 建立最理想的腫瘤模型：人體腫瘤組織的培養(yǎng)為測(cè)試化療藥在病人自身的經(jīng)培養(yǎng)和分化的腫瘤上的療效奠定了基礎(chǔ)，決定化療藥成分的有效性，從而避免了化療藥的盲目使用。以前這些試驗(yàn)是在鼠的組織模型上進(jìn)行的，但由于物種差異，人的許多腫瘤在鼠中的生長(zhǎng)情況并不好，如最好的結(jié)腸腫瘤的移植率才為60％，而乳腺腫瘤為8－10％，前列腺腫瘤為0。但在RCCS中，結(jié)腸、乳腺、前例腺、卵巢、肺和腦等其它腫瘤組織都能得到很好的生長(zhǎng)。至今沒(méi)有見到在RCCS中腫瘤組織是不生長(zhǎng)的。而且，這些腫瘤模型避免了以前鼠蛋白的干擾。
7.建立最理想的AIDS/HIV模型：在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院中有50臺(tái)RCCS用來(lái)進(jìn)行組織研究。以前研究者很難對(duì)HIV的感染者進(jìn)行早期的跟蹤，因?yàn)椴∪顺３Ｔ诒辉\斷出的幾年前已經(jīng)感染了該病毒。而且跟蹤研究需要大量的樣本，病人不愿讓研究者經(jīng)常進(jìn)行活體取樣，這是可理解的�，F(xiàn)在有了RCCS，研究者可培養(yǎng)正常人的器官、腺體和淋巴結(jié)。他們用HIV來(lái)感染這些類器官，然后跟蹤HIV的生長(zhǎng)。AZT已被證明在已感染的病人和這些被感染的類器官上具有相同的效果。現(xiàn)在研究者把其它的HIV藥物用在被HIV感染的RCCS培養(yǎng)出來(lái)的組織模型上，從而研究它們對(duì)抗HIV的效果及其對(duì)抗方式。
8.在組織移植中：例如，RCCS培養(yǎng)出來(lái)的肝臟在病理學(xué)家的看來(lái)和正常人的肝臟沒(méi)有什么區(qū)別，使得目前進(jìn)行局部的肝臟組織移植成為可能。
9.在皮膚移植中：在RCCS誕生之前，用普通的組織培養(yǎng)裝置的產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行皮膚組織移植已有好幾年了。然而，以前培養(yǎng)出來(lái)的皮膚無(wú)論在肌理和靈巧度上，還是在膚色上，與真皮都有很大的差距。用RCCS培養(yǎng)出來(lái)的皮膚具有極高分化度，其外觀和感覺(jué)可以亂真。

II.【發(fā)明的起因】NASA在研究可在宇宙間培養(yǎng)細(xì)胞并且返回到地球時(shí)細(xì)胞仍能成活的裝置的同時(shí)發(fā)明了旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary Cell Culture System 即RCCS)，她使得生物學(xué)家可以在地球上進(jìn)行體外培養(yǎng)復(fù)雜的人及其它哺乳動(dòng)物的組織。RCCS在98年11月隨"發(fā)現(xiàn)號(hào)"航天飛機(jī)一起遨游太空。

III.【與類似產(chǎn)品根本區(qū)別】大家知道，普通的細(xì)胞和組織培養(yǎng)裝置已有100多年的歷史，RCCS 為何如此引人注目呢？是什么使她比普通的培養(yǎng)裝置優(yōu)越呢？有三大理由：
(1)高分化度。分化是指當(dāng)細(xì)胞組織被再生時(shí)，其扮演不同的角色來(lái)模仿人體中同樣的組織結(jié)構(gòu)和功能。即肝組織代謝毒素和分泌膽汁，骨髓產(chǎn)生血細(xì)胞和血小板，胰島產(chǎn)生胰島素，腫瘤組織增長(zhǎng)瘋狂。有了這項(xiàng)發(fā)明，分化的人體組織能在實(shí)驗(yàn)室中生長(zhǎng)，用來(lái)模仿科學(xué)家們感興趣的器官和腫瘤。
(2)模擬微重力。以前要想在體外模擬正常組織的微環(huán)境由于細(xì)胞外基質(zhì)的復(fù)雜性和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性而受阻，而此細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞核基質(zhì)蛋白是很重要的。重力就是問(wèn)題之一，它將分裂原本應(yīng)在一起的細(xì)胞組織成分，而RCCS解決了這個(gè)問(wèn)題。
(3)完善的三維細(xì)胞培養(yǎng)。一般的生物反應(yīng)器依賴的方法是保持細(xì)胞的懸浮從而導(dǎo)致剪切力的產(chǎn)生. 這剪切力使細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)間的穩(wěn)定性遭到破壞。 這樣組織和細(xì)胞集中于自身的修復(fù), 從而大大影響其生長(zhǎng)和其它的正常生理功能。
大家知道, 培養(yǎng)大量細(xì)菌采用發(fā)孝罐, 現(xiàn)在人們往往把發(fā)孝罐也拿來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞和組織，但結(jié)果卻不理想。原因是發(fā)孝罐不是為此而設(shè)計(jì)的, 發(fā)孝罐對(duì)于人及其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞組織的培養(yǎng)不合適的原因主要是很難把大量的細(xì)胞移植到發(fā)孝罐中, 即使能夠培養(yǎng), 所得的細(xì)胞數(shù)也有限, 且很難生成組織。而RCCS解決了這個(gè)問(wèn)題，它對(duì)細(xì)胞和組織培養(yǎng)是最理想的, 而且可以用于大規(guī)模生產(chǎn)。這主要是因?yàn)樵赗CCS中細(xì)胞的成活率平均可達(dá)97%, 并且細(xì)胞的分化程度是其它裝置所不可比擬的。

IV.【RCCS系統(tǒng)介紹】RCCS是非常精巧的，其圓柱狀的組織培養(yǎng)容器中充滿了用作培養(yǎng)基的生長(zhǎng)液，同時(shí)加入細(xì)胞或組織材料。整個(gè)容器由電機(jī)驅(qū)動(dòng)，沿水平軸旋轉(zhuǎn)。細(xì)胞或組織顆粒在水平軸內(nèi)建立一個(gè)均質(zhì)的液體懸浮軌道。培養(yǎng)基以及細(xì)胞和組織顆粒隨容器一起旋轉(zhuǎn)且不與容器壁和其它任何東西相撞。由于系統(tǒng)無(wú)推進(jìn)器、空氣升液器、氣泡或攪拌器，使得破壞性的應(yīng)力減到最小。RCCS中的細(xì)胞通過(guò)一個(gè)如人工肺膜式氣體交換器來(lái)吸收氧氣和排出二氧化碳。任何可能產(chǎn)生的氣泡都被清除，因?yàn)榧词褂袠O少的旋渦，細(xì)胞的生長(zhǎng)也會(huì)受到影響。破壞應(yīng)力的去除使得生成的三維組織具有與父系組織相同的結(jié)構(gòu)和功能。在RCCS中組織的培養(yǎng)密度可達(dá)10E10至10E11個(gè)細(xì)胞/ml；而細(xì)胞的培養(yǎng)密度達(dá)10E8。至今還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有哪一種類型的細(xì)胞或組織在RCCS中生長(zhǎng)不成功的并且已有幾百種類型得到生長(zhǎng)。在全世界已有2000多臺(tái)RCCS，其中包括在中國(guó)。