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特點(diǎn)：
●得到單細(xì)胞水平上反應(yīng)細(xì)胞生理功能的各種細(xì)胞內(nèi)特征的海量數(shù)據(jù)
●采用免洗一步染料標(biāo)記法，操作簡單，實(shí)時(shí)檢測， 結(jié)果準(zhǔn)確
●使用高通量/高內(nèi)涵檢測的方法，獲得海量數(shù)據(jù)，進(jìn)行大數(shù)據(jù)比對分析，建立網(wǎng)絡(luò)集成式細(xì)胞內(nèi)特征的公共數(shù)據(jù)庫，為人類對疾病的了解、新藥研發(fā)及個(gè)性化治療提供有力的數(shù)據(jù)支撐和手段
美國國立衛(wèi)生研究院NIH 正在進(jìn)行的建立網(wǎng)絡(luò)集成式細(xì)胞內(nèi)特征的公共數(shù)據(jù)庫（LINCS）項(xiàng)目，旨在開發(fā)細(xì)胞水平上藥物特性的生物學(xué)標(biāo)簽，通過監(jiān)視細(xì)胞內(nèi)表型的變化動(dòng)態(tài)反映藥物作用機(jī)制，使我們能迅速了解個(gè)體細(xì)胞的藥物功能基因組學(xué)和藥物代謝組學(xué)的特征。
Cellarium（A Live-Cell Microarray for High-Throughput Observation of Metabolic Biosignatures） 技術(shù)是以NIH NHGRI（National Human Genome Research Institute）CEGS（Center of Excellence in Genomic Sciences）Microscale Life Sciences Center開發(fā)的技術(shù)衍生出來的，隸屬于上述NIH LINCS項(xiàng)目的一部分。這種技術(shù)通過單細(xì)胞代謝分析，致力于開發(fā)單細(xì)胞水平的藥物特性的代謝圖譜。The LINCS Tech U01 可以支持新一代高通量系統(tǒng)的發(fā)展并將數(shù)據(jù)儲(chǔ)存到LINCS數(shù)據(jù)庫中。利用ImageXpress® Micro 高內(nèi)涵分析系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)快速的高分辨率圖像采集，以得到單細(xì)胞水平上反應(yīng)細(xì)胞各種生物特征的數(shù)據(jù)分析和處理。
在美國NIH LINCS項(xiàng)目中，利用高內(nèi)涵成像分析技術(shù)平臺(tái)可獲得單個(gè)細(xì)胞水平的各種生物學(xué)特征，如固定細(xì)胞中蛋白的免疫檢測、活細(xì)胞凋亡圖像分析、蛋白激酶生化分析以及細(xì)胞活力相關(guān)的生理參數(shù)，為研究者和臨床診斷醫(yī)生探測單細(xì)胞個(gè)體分析和如何用藥提供了一個(gè)獨(dú)特的工具。
流程圖
圖1 高通量單細(xì)胞分析流程圖
圖1概括了cellarium 技術(shù)的工作流程。首先，將細(xì)胞種到微孔中并在正常條件下進(jìn)行培養(yǎng)（在孵育之前，要先加入實(shí)驗(yàn)需要的各種刺激因子）。將傳感器微陣列壓在細(xì)胞微孔陣列上后，就完成了單細(xì)胞分離和密封的步驟了。然后，在一個(gè)精確的時(shí)間段內(nèi)對芯片進(jìn)行高速掃描就可以得到相應(yīng)的參數(shù)包括耗氧率，胞外pH變化以及糖攝取狀況等。這些數(shù)據(jù)與癌細(xì)胞代謝，正常細(xì)胞生長發(fā)育以及一系列的人類疾病相關(guān)。此外，胞內(nèi)的熒光傳感器可以擴(kuò)大檢測參數(shù)的范圍，其中包括ATP等，通過高內(nèi)涵圖像采集及分析系統(tǒng)將單細(xì)胞熒光圖像存儲(chǔ)并分析，得到大量單細(xì)胞生理參數(shù)。這些數(shù)據(jù)被整理并上傳到LINCS公共數(shù)據(jù)庫中，供所有的研究者查閱。
分離單細(xì)胞傳感器微陣列：
傳統(tǒng)的大量細(xì)胞群體的生理特征測量只是細(xì)胞對刺激的平均反應(yīng)，科研工作者們希望測量單個(gè)細(xì)胞水平上的生理參數(shù)，以研究細(xì)胞代謝、異質(zhì)性及疾病發(fā)生早期。近期研究的單細(xì)胞代謝大部分基于熒光傳感器系統(tǒng)，因?yàn)檫@種系統(tǒng)是非侵入性的、一次性的、可遠(yuǎn)程遙控的測量生化參數(shù)的方法。
應(yīng)用化學(xué)方法可成功制造出各種尺寸的的圓點(diǎn)傳感器，小至3微米，且成功率超過90%（圖2）。以耗氧率傳感器為例，設(shè)計(jì)出了“l(fā)id-on-top”樣式的微室，微室頂部的“l(fā)id”部分按已設(shè)計(jì)好的圖案放置傳感器；細(xì)胞生長于微孔底部，微孔的直徑是固定的，在50-100微米之間，因此放置傳感器的圖形要經(jīng)過精確的計(jì)算以達(dá)到高信噪比�！發(fā)id”部分安放在PDMS（polydimethylsiloxane）材料的活塞上，蓋上活塞時(shí)機(jī)械力可在包含傳感器的”lid”和芯片底部的細(xì)胞之間產(chǎn)生密封效果。當(dāng)光從芯片下方照射時(shí)，測量并記錄傳感器激發(fā)強(qiáng)度，且此強(qiáng)度與微室中氧濃度有對應(yīng)關(guān)系，經(jīng)過計(jì)算就可得到氧氣濃度（圖3）。
圖2 Lid-on-top結(jié)構(gòu)示意圖。傳感器按一定圖案放置于頂部的lid，將有細(xì)胞的微室底部分成更小的范圍，形成單細(xì)胞區(qū)域。
圖3 單細(xì)胞耗氧率動(dòng)態(tài)代謝檢測及分析
一步染色法檢測細(xì)胞對藥物的敏感性
應(yīng)用ImageXpress® Micro高內(nèi)涵成像系統(tǒng)可快速、方便、高通量的測量細(xì)胞對小分子藥物的多參數(shù)生理變化，并且使用三種熒光染料對活細(xì)胞進(jìn)行染色，只需一步，無需清洗，對于貼壁性不好的有絲分裂細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，這種方法比傳統(tǒng)的基于免疫熒光染色的方法更加準(zhǔn)確。應(yīng)用此法得到的數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳到NIH的LINCS公共數(shù)據(jù)庫中(http://lincs.hms.harvard.edu/)。
在傳統(tǒng)免疫熒光法和一步熒光染料法的對比實(shí)驗(yàn)中，免疫熒光法用phospho(Ser10) Histone H3標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞，antcleaved PARP1標(biāo)記凋亡細(xì)胞。染料法用LysoTracker-Red顯示細(xì)胞形態(tài)，DEVDNucView488 caspase-3標(biāo)記凋亡細(xì)胞。兩種方法均用Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞核。免疫熒光法是將細(xì)胞固定后進(jìn)行抗體染色步驟，包括沖洗板子，而熒光染料法是染色后再固定細(xì)胞，并且在采集圖像前沒有沖洗的步驟。
實(shí)驗(yàn)中用典型的抗有絲分裂藥物紫杉醇處理人膀胱癌5637細(xì)胞（圖4）。在無藥物的對照組，這兩種實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果十分相近，包括細(xì)胞密度、細(xì)胞核形態(tài)、%有絲分裂、%凋亡細(xì)胞。在紫杉醇處理24小時(shí)后，兩種實(shí)驗(yàn)方法中的有絲分裂細(xì)胞數(shù)均顯示出明顯增加。但是，凋亡細(xì)胞數(shù)在免疫熒光法中明顯少于熒光染料法。這說明免疫熒光法沖洗板子的過程雖然可以有效的保留有絲分裂細(xì)胞，但會(huì)使凋亡細(xì)胞損失。為了證明這一結(jié)論，我們用紫杉醇處理細(xì)胞48小時(shí)后，用熒光染料法染色，先按正常程序不沖洗，采集下圖像后，再用PBS沖洗三次模擬免疫熒光法，采集同樣位置的圖像，沖洗前后的圖像對比如圖4C所示。沖洗后，NucView488陽性細(xì)胞大量減少，另外，洗前的圖像中有很多圓形、脹大、模糊的被LysoTracker-Red和NucView488染色很弱的核，而在沖洗后這些核完全丟失了。從細(xì)胞形態(tài)及染色情況看，這些應(yīng)屬于晚期凋亡細(xì)胞。
接下來我們評估了熒光染色高內(nèi)涵法的自動(dòng)表型算法（圖5）。5637細(xì)胞分別經(jīng)過DMSO、200nM紫杉醇處理24小時(shí)、200nM紫杉醇處理48小時(shí)。不同表型的細(xì)胞被不同顏色輪廓標(biāo)記出來：分裂間期細(xì)胞為白色，有絲分裂細(xì)胞為紅色，早期凋亡細(xì)胞為綠色，晚期凋亡細(xì)胞為黃色。為了評估自動(dòng)分析的準(zhǔn)確性，我們從每種處理中隨意挑選了12張圖片進(jìn)行手動(dòng)計(jì)數(shù)，作為標(biāo)準(zhǔn)與自動(dòng)分析結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示兩種計(jì)算方法非常相近，雖然自動(dòng)分析中間期細(xì)胞數(shù)量略高，有絲分裂和凋亡細(xì)胞數(shù)量略低，但是誤差很小，并不影響藥物評價(jià)。
圖4 人類膀胱癌5637細(xì)胞基于抗體和基于染料的實(shí)驗(yàn)對比。（A）基于抗體和基于染料的實(shí)驗(yàn)中單一通道和疊加圖像的對比，DMSO對照（左）和200nM紫杉醇（右）處理24小時(shí)。（B）柱狀圖顯示了兩種實(shí)驗(yàn)方法在DMSO和200nM紫杉醇處理24小時(shí)處理后的對比，對比參數(shù)包括總細(xì)胞數(shù)、有絲分裂細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)。所有的細(xì)胞計(jì)數(shù)都是每孔統(tǒng)計(jì)了超過4個(gè)視野，并取超過48個(gè)重復(fù)孔的平均值得到的。（C）細(xì)胞被200nM紫杉醇處理48小時(shí)后用染料染色，對比實(shí)驗(yàn)孔板在沖洗前后同一位置單一通道和疊加圖像。
圖5 染色實(shí)驗(yàn)方法的圖像自定義分析分割結(jié)果。5637細(xì)胞在DMSO、200nM紫杉醇處理24小時(shí)和200nM紫杉醇處理48小時(shí)后的原始圖像（上）和Hoechst分析圖像（下）。分裂間期細(xì)胞為白色，有絲分裂細(xì)胞為紅色，早期凋亡細(xì)胞為綠色，晚期凋亡細(xì)胞為黃色。（B）自動(dòng)分析（藍(lán)色）和手工計(jì)數(shù)（紅色）的比較，依次為總細(xì)胞數(shù)、有絲分裂細(xì)胞數(shù)、凋亡細(xì)胞數(shù)和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)。所有的細(xì)胞數(shù)均為超過12個(gè)圖像的平均值。
單細(xì)胞分析的未來
目前科學(xué)界認(rèn)為，如果能深入了解單細(xì)胞的行為以及它們和微環(huán)境的相互作用，就能衍生出很多具有沖擊性的發(fā)現(xiàn)。從近來的綜述性文章我們可以發(fā)現(xiàn)，研究單細(xì)胞分析技術(shù)尤其是從傳統(tǒng)細(xì)胞研究方法向高通量單細(xì)胞分析方法轉(zhuǎn)變是必要的。
LINCS項(xiàng)目不僅擁有全新的高通量平臺(tái)測序技術(shù)及平臺(tái)，包括ImageXpress® Micro高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)等，使之可以準(zhǔn)確找到如單細(xì)胞代謝率的生物學(xué)標(biāo)簽的實(shí)時(shí)信號(hào)改變；更重要是在于對進(jìn)行大規(guī)模數(shù)據(jù)庫的建立和大數(shù)據(jù)的分析，使我們在后基因組時(shí)代進(jìn)一步加快了轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)及單細(xì)胞代謝組學(xué)等的發(fā)展。LINCS技術(shù)得到的海量數(shù)據(jù)信息和分析比對結(jié)果將極大影響人類對生命科學(xué)的研究及對人類疾病的了解，從而進(jìn)一步改善人類的環(huán)境、醫(yī)療及健康狀況。同時(shí)為制藥/診斷公司提供了一個(gè)商業(yè)契機(jī)，可以利用LINCS技術(shù)平臺(tái)為研究者或臨床醫(yī)生提供更為準(zhǔn)確可靠的生物學(xué)數(shù)據(jù)或個(gè)性化的診斷數(shù)據(jù)。
近50篇高內(nèi)涵應(yīng)用介紹：
http://www.moleculardevices.com/library/search?keywords=&types=8&product=302
