摘要：本文深入剖析了電穿孔與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染懸浮貼壁細(xì)胞的效率。通過詳細(xì)闡述兩種轉(zhuǎn)染方法的原理，精心設(shè)計(jì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，從轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性等多方面進(jìn)行研究。結(jié)果表明，電穿孔法轉(zhuǎn)染效率較高但細(xì)胞毒性大，脂質(zhì)體法細(xì)胞毒性低但轉(zhuǎn)染效率受多種因素影響，為細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的選擇提供了有力參考。

引言

在現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)作為一種將外源性基因?qū)�入�?xì)胞內(nèi)的重要手段，發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中，電穿孔法和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是兩種常用的轉(zhuǎn)染方法。深入了解這兩種方法對(duì)懸浮貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，對(duì)于科研人員選擇合適的轉(zhuǎn)染策略具有重要意義。

一、電穿孔與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染原理

（1）電穿孔轉(zhuǎn)染原理

電穿孔法是一種物理介導(dǎo)的基因遞送方法。其原理是利用瞬間高壓電場(chǎng)使細(xì)胞膜可逆性穿孔，同時(shí)細(xì)胞膜上電勢(shì)升高，驅(qū)使帶電荷的分子（如 DNA）以電泳方式穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。

（2）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染原理

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是一種化學(xué)介導(dǎo)的基因遞送方法。陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將 DNA 分子包裹入內(nèi)，形成 DNA - 脂質(zhì)體復(fù)合物。該復(fù)合物隨后被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞。

二、實(shí)驗(yàn)材料與方法

（1）實(shí)驗(yàn)材料

選取常見哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如 HeLa（人宮頸癌細(xì)胞）作為貼壁細(xì)胞代表、CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）部分作為懸浮細(xì)胞部分研究、K562（人髓系白血病細(xì)胞）作為懸浮細(xì)胞。用含 10% 胎牛血清、100u/ml 青霉素、100μg/ml 鏈霉素的 DMEM 高糖培養(yǎng)基，于 37°C、5% CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將目的基因片段（如 GFP 報(bào)告基因）克隆至真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選、擴(kuò)增，提取質(zhì)粒用無內(nèi)毒素試劑盒純化。準(zhǔn)備電穿孔儀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、離心機(jī)、培養(yǎng)板、微量移液器、離心管等器材。

（2）電穿孔法轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化、離心收集沉淀，用預(yù)冷電轉(zhuǎn)緩沖液重懸至合適密度。將適量 DNA 加入細(xì)胞懸液中，充分混合后轉(zhuǎn)移至電穿孔樣品池中。在電穿孔裝置上設(shè)置合適的輸出電壓、脈沖寬度等參數(shù)，啟動(dòng)電穿孔裝置供給電脈沖。電處理后，向小池加 1ml 普通培養(yǎng)基，將細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)容器中，放回孵育箱中使之在正常條件下生長。

（3）脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟

以不同比例（脂質(zhì)體∶質(zhì)粒 = 1∶1 - 5∶1）將脂質(zhì)體與質(zhì)粒 DNA 輕柔混合，室溫孵育 20 - 30 分鐘形成復(fù)合物。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將細(xì)胞鋪板，使細(xì)胞密度達(dá)到匯合率為 70% - 90%。吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用 PBS 或者無血清培養(yǎng)基清洗一次，更換無血清培養(yǎng)基。將復(fù)合物逐滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿，輕輕搖勻，37°C 孵育 4 - 6 小時(shí)后換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)特定時(shí)長觀察轉(zhuǎn)染效果。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）轉(zhuǎn)染效率對(duì)比

在 HeLa 細(xì)胞中，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染效率隨脂質(zhì)體比例升高漸增，至 3∶1 達(dá)約 30% 平臺(tái)期；電穿孔法在 200V、30μF 時(shí)效率超 50%。在 CHO 細(xì)胞中，脂質(zhì)體法效率普遍低于 20%，電穿孔法依優(yōu)化參數(shù)可達(dá) 40% 左右。對(duì)于 K562 細(xì)胞，電穿孔轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率明顯高于脂質(zhì)體法，在特定參數(shù)下能達(dá)到 60% 以上，而脂質(zhì)體法最高僅約 25% 。由此可見，電穿孔法在多數(shù)細(xì)胞系中展現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率，尤其對(duì)于懸浮細(xì)胞更為顯著。

（2）細(xì)胞毒性分析

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)正常，細(xì)胞活力在較高脂質(zhì)體比例時(shí)有所下降，但仍能保持在 70% 以上。電穿孔轉(zhuǎn)染后，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓等現(xiàn)象，細(xì)胞活力明顯降低，尤其在高電壓、長時(shí)間脈沖條件下，細(xì)胞活力可降至 50% 以下。這表明脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的細(xì)胞毒性相對(duì)較低，對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)影響較小。

（3）影響因素探討

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率受脂質(zhì)體與 DNA 比例、細(xì)胞密度、血清等因素影響。過高或過低的脂質(zhì)體比例都不利于轉(zhuǎn)染，合適的細(xì)胞密度能保證細(xì)胞健康且利于復(fù)合物攝取。血清中的蛋白可能與脂質(zhì)體或 DNA 結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染效果。電穿孔轉(zhuǎn)染效率則主要取決于電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖寬度和細(xì)胞類型。不同細(xì)胞對(duì)電場(chǎng)的耐受性不同，需優(yōu)化參數(shù)以提高轉(zhuǎn)染效率并降低細(xì)胞毒性。

四、應(yīng)用場(chǎng)景與展望

（1）應(yīng)用場(chǎng)景

在基礎(chǔ)研究中，若對(duì)細(xì)胞毒性要求較低，追求高轉(zhuǎn)染效率，如構(gòu)建基因過表達(dá)或敲低細(xì)胞模型，電穿孔法較為適用。而在藥物篩選、細(xì)胞治療等對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)要求較高的應(yīng)用中，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法因細(xì)胞毒性低更具優(yōu)勢(shì)。例如在腫瘤細(xì)胞的基因治療研究中，需要考慮治療載體對(duì)細(xì)胞的損傷，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染可作為重要手段 。

（2）研究展望

未來，細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展將朝著提高轉(zhuǎn)染效率、降低細(xì)胞毒性、增強(qiáng)靶向性的方向進(jìn)行。對(duì)于電穿孔法，可能會(huì)開發(fā)更精準(zhǔn)的電場(chǎng)調(diào)控技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞群體的高效轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方面，新型脂質(zhì)體材料的研發(fā)有望進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)降低其對(duì)細(xì)胞的不良影響。此外，結(jié)合多種轉(zhuǎn)染技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，開發(fā)聯(lián)合轉(zhuǎn)染方法也是一個(gè)潛在的研究方向。

綜上所述，電穿孔和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在懸浮貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染中各有優(yōu)劣�？蒲腥藛T在選擇轉(zhuǎn)染方法時(shí)，應(yīng)綜合考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康�、�?xì)胞類型、對(duì)細(xì)胞毒性的耐受程度等因素，以實(shí)現(xiàn)最佳的轉(zhuǎn)染效果。