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磷酸鈣鹽沉淀法構(gòu)建雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

瀏覽次數(shù):57 發(fā)布日期:2025-1-8  來源:威尼德生物科技
摘要

本文旨在探討利用磷酸鈣鹽沉淀法構(gòu)建表達(dá)血管緊張素II受體1型(AT1)和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II(CaMKII)的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的可行性,并分析其在基因功能研究中的應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,磷酸鈣鹽沉淀法能有效實(shí)現(xiàn)雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,為基因表達(dá)與功能研究提供了可靠的平臺(tái)。

引言

在分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù),能夠?qū)⑼庠碊NA引入宿主細(xì)胞,從而表達(dá)特定的基因或進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)在基因功能研究、藥物篩選、基因治療等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)外源基因的關(guān)鍵步驟,對(duì)于深入探究基因功能具有重要意義。

磷酸鈣鹽沉淀法是一種經(jīng)典的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法,具有成本低廉、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),適用于大多數(shù)類型的細(xì)胞。然而,傳統(tǒng)的磷酸鈣鹽沉淀法主要用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,對(duì)于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的研究相對(duì)較少。本文旨在探討利用磷酸鈣鹽沉淀法構(gòu)建雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的可行性,并分析其在基因功能研究中的應(yīng)用價(jià)值。

材料與方法
1. 材料
  • 細(xì)胞株:COS7細(xì)胞
  • 質(zhì)粒:帶HA-tag的AT1質(zhì)粒(WT,小鼠來源);帶V5-tag的CaMKII質(zhì)粒(δB/WT,小鼠來源)
  • 試劑:某試劑(包括CaCl₂、PBS、2×HBS緩沖液、G418等)
  • 儀器:瓊脂糖凝膠電泳儀、聚丙烯酰胺凝膠電泳及半干法電轉(zhuǎn)儀、熒光顯微鏡等
2. 方法
2.1 質(zhì)粒制備與鑒定
  1. 質(zhì)粒擴(kuò)增與抽提:將AT1和CaMKII質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中,擴(kuò)增后使用Qiagen質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提。
  2. 質(zhì)粒鑒定:通過雙酶切法及瓊脂糖電泳鑒定目的DNA片段,確保質(zhì)粒濃度與純度符合要求,無蛋白和RNA污染。
2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與鋪板
  1. 細(xì)胞培養(yǎng):使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)COS7細(xì)胞。
  2. 細(xì)胞鋪板:待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期,用胰酶消化后接種至6孔培養(yǎng)板,每孔接種2×10^5個(gè)細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后開始轉(zhuǎn)染。
2.3 磷酸鈣鹽沉淀法制備與轉(zhuǎn)染
  1. 轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備:更換新鮮培養(yǎng)基,確保細(xì)胞密度約為80%。
  2. 制備磷酸鈣-DNA沉淀:將質(zhì)粒DNA(AT1和CaMKII)與CaCl₂混合,再加入2×HBS緩沖溶液,靜置20分鐘后形成磷酸鈣-DNA沉淀。
  3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將磷酸鈣-DNA沉淀加入細(xì)胞培養(yǎng)基中,輕輕搖勻后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。
  4. 孵育與篩選:孵育8-24小時(shí)后,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后使用G418進(jìn)行抗性篩選,每3-4天更換一次選擇培養(yǎng)基,直至出現(xiàn)抗藥性的細(xì)胞克隆。
2.4 檢測(cè)與鑒定
  1. 免疫熒光法(IF):使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞表面表達(dá)的AT1(及其所帶的HA-tag)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)的CaMKII(及其所帶的V5-tag)。
  2. 免疫印跡法(WB):提取細(xì)胞蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后使用特異性抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè),驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)。
  3. 功能檢測(cè):給予轉(zhuǎn)染細(xì)胞血管緊張素II(AngII)刺激,使用Western blot檢測(cè)磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)的改變,評(píng)估AT1和CaMKII的相互作用。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 質(zhì)粒鑒定結(jié)果

質(zhì)粒酶切后電泳結(jié)果顯示,目的長(zhǎng)度DNA片段清晰可見,表明質(zhì)粒制備成功,濃度與純度符合要求。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選結(jié)果

通過磷酸鈣鹽沉淀法將AT1和CaMKII質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞后,經(jīng)過G418抗性篩選,成功獲得抗藥性的細(xì)胞克隆。免疫熒光法和免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染細(xì)胞中AT1和CaMKII蛋白表達(dá)陽性,而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中則無表達(dá)。

3. 功能檢測(cè)結(jié)果

給予轉(zhuǎn)染細(xì)胞AngII刺激后,Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染AT1和CaMKII/WT的細(xì)胞產(chǎn)生p-ERK升高反應(yīng),該反應(yīng)可被AT1受體拮抗劑(ARB)預(yù)處理消除。而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染AT1和CaMKII/DN的細(xì)胞無類似反應(yīng),進(jìn)一步證實(shí)DN為無功能抑制體。

討論
1. 磷酸鈣鹽沉淀法在構(gòu)建雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中的可行性

本研究成功利用磷酸鈣鹽沉淀法構(gòu)建了表達(dá)AT1和CaMKII的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)COS7細(xì)胞系。磷酸鈣鹽沉淀法因其成本低廉、操作簡(jiǎn)便而被廣泛應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。本研究通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和篩選策略,成功實(shí)現(xiàn)了雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建。這一結(jié)果表明,磷酸鈣鹽沉淀法在構(gòu)建雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中具有可行性。

2. 雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系在基因功能研究中的應(yīng)用價(jià)值

穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系能夠在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)外源基因,為基因功能研究提供了可靠的平臺(tái)。本研究構(gòu)建的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系能夠同時(shí)表達(dá)AT1和CaMKII,為研究二者在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相互作用提供了有力的工具。通過給予AngII刺激,觀察到p-ERK的改變,進(jìn)一步證實(shí)了AT1和CaMKII在ERK信號(hào)通路中的相互作用。這一結(jié)果為深入探究AT1和CaMKII的功能及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要線索。

3. 實(shí)驗(yàn)策略的創(chuàng)新性

本研究在實(shí)驗(yàn)策略上具有以下創(chuàng)新性:

  1. 雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染:傳統(tǒng)磷酸鈣鹽沉淀法主要用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,本研究通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件和篩選策略,成功實(shí)現(xiàn)了雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建。
  2. 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建:利用G418抗性篩選,成功獲得抗藥性的細(xì)胞克隆,為長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因表達(dá)提供了保障。
  3. 功能檢測(cè):通過給予AngII刺激,觀察p-ERK的改變,為評(píng)估AT1和CaMKII的相互作用提供了直接證據(jù)。
4. 研究的應(yīng)用前景

本研究構(gòu)建的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系具有廣泛的應(yīng)用前景:

  1. 基因功能研究:可用于深入研究AT1和CaMKII在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的相互作用及其調(diào)控機(jī)制。
  2. 藥物篩選:可作為模型系統(tǒng),用于高通量篩選和評(píng)估針對(duì)AT1和CaMKII的藥物藥效和安全性。
  3. 疾病模型構(gòu)建:可用于模擬與AT1和CaMKII相關(guān)的疾病狀態(tài),為疾病機(jī)理研究和治療策略開發(fā)提供平臺(tái)。
結(jié)論

本研究成功利用磷酸鈣鹽沉淀法構(gòu)建了表達(dá)AT1和CaMKII的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)COS7細(xì)胞系,并驗(yàn)證了其在基因功能研究中的應(yīng)用價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,磷酸鈣鹽沉淀法在構(gòu)建雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中具有可行性,且構(gòu)建的雙質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系為深入探究AT1和CaMKII的功能及其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用提供了有力的工具。本研究為基因功能研究、藥物篩選和疾病模型構(gòu)建提供了新的思路和方法,具有廣泛的應(yīng)用前景。

來源:威尼德生物科技(北京)有限公司
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