隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米顆粒（NPs）已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，但其對人體健康的長期影響仍不明確。近期研究利用CERO 3D細胞類器官培養(yǎng)系統(tǒng)等創(chuàng)新技術(shù)，深入探究了納米顆粒對細胞的長期影響。

研究背景與意義
傳統(tǒng)細胞毒性測試多關(guān)注短期暴露，難以評估納米顆粒長期接觸細胞的潛在風(fēng)險。CERO 3D系統(tǒng)為研究提供了新工具，有助于理解納米顆粒與細胞的相互作用，為納米材料的安全應(yīng)用提供理論支持。

實驗方法和結(jié)果
細胞毒性測定
研究選擇了EAhy 926內(nèi)皮細胞和THP-1單核細胞，使用CASY系統(tǒng)精確控制細胞數(shù)量。內(nèi)皮細胞采用CERO 3D培養(yǎng)和傳統(tǒng)傳代培養(yǎng)，單核細胞在CELLine CL350生物反應(yīng)器中培養(yǎng)（圖1）。實驗選用了多種納米顆粒，通過先進技術(shù)全面表征其物理化學(xué)性質(zhì)，并使用熒光標記的納米顆粒精確測定細胞攝取率。細胞毒性測定采用CellTiter 96® AQueous非放射性細胞增殖測定法（基于甲臜生物還原原理），能夠精準評估納米顆粒對細胞增殖的影響。
 

圖1：暴露方案：A：在臺式生物反應(yīng)器BioLevitator中微珠上培養(yǎng)細胞。B：在CELLine 350燒瓶生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細胞。C：當(dāng)對照細胞達到融合度時將所有細胞轉(zhuǎn)移到更大的培養(yǎng)容器中（C1），或者在新的相同大小的培養(yǎng)容器中以1:10的比例收獲并傳代細胞（C2）。

選擇暴露系統(tǒng)對細胞毒性測試結(jié)果至關(guān)重要，不是所有系統(tǒng)都同樣有效。CELLine CL350系統(tǒng)不適合評估THP-1細胞的慢性細胞毒性，因為它對細胞密度敏感。在細胞毒性測試中，需要避免高細胞密度以防止生長抑制。在CELLine CL350系統(tǒng)中，只有低細胞密度條件下才能進行長達16天的觀察，但細胞生長不可重復(fù)。傳代實驗中，直接轉(zhuǎn)移所有細胞的方法（圖1C1）比每周1:10傳代的方法更可靠（圖1C2）。長期細胞毒性的濃度通常是急性細胞毒性濃度的一半，不同納米顆粒的長期和短期暴露毒性濃度差異顯著。

針對不同細胞類型和培養(yǎng)系統(tǒng)，研究人員精心設(shè)置了合理的暴露濃度范圍，如聚苯乙烯顆粒為12.5 - 25 - 50 μg/ml，二氧化硅顆粒為25 - 50 - 100 μg/ml，SCNTs為5 - 10 - 20 μg/ml。同時，確定了不同培養(yǎng)條件下的最長評估時間，在CERO 3D 細胞類器官培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)的EAhy926 細胞最長評估時間可達28天，在CELLine CL350 中培養(yǎng)的THP - 1細胞為16天，傳代培養(yǎng)的EAhy926細胞和THP - 1細胞為16天，為全面評估納米顆粒的短期和長期細胞毒性提供了可靠依據(jù)。

納米顆粒性質(zhì)變化與細胞攝取
結(jié)果顯示，納米顆粒在培養(yǎng)基中行為復(fù)雜，團聚現(xiàn)象明顯，部分積累在細胞溶酶體中。細胞對納米顆粒的攝取率因類型而異，攝取率與細胞毒性之間無簡單線性關(guān)系。

圖2：EAhy926細胞在暴露于紅色熒光標記的納米顆粒PPS20（A）、SiO2（B）和SCNTc（C）24小時后的攝取情況。顆粒（紅色）與溶酶體（通過綠色熒光活性染料LysoTracker識別）在不同程度上共定位。共定位顯示為黃色。比例尺：20微米。

所有納米顆粒均出現(xiàn)了不同程度的團聚，羧基化單壁碳納米管迅速聚集成束，單管比例微乎其微；聚苯乙烯顆粒和二氧化硅顆粒的尺寸在培養(yǎng)基中顯著增大。與此同時，納米顆粒部分積累在細胞溶酶體中，細胞對納米顆粒的攝取率因細胞類型而異，EAhy926 細胞攝取率約為2%，THP-1細胞約為7%。

研究微載體培養(yǎng)中納米顆粒的作用模式與長期效應(yīng)
CERO的這個載體培養(yǎng)系統(tǒng)（70小時）比常規(guī)培養(yǎng)（30小時）更有效。EAhy 926細胞在GEM™表面上增殖，并通過Hoechst 33342、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)活性染色顯示細胞活力，同時紅色熒光PPS主要在溶酶體中定位。
 

圖3：在優(yōu)化微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中加入無毒濃度的20 nm和200 nm PPS及MWCNT納米顆粒，每周更新培養(yǎng)基。采用Hoechst 33342染色觀察細胞附著（3 A），用ER-Tracker green和MitoTracker DeepRed 633標記細胞器評估細胞活力(3 B)，并用紅色熒光PPS追蹤納米顆粒定位（主要至溶酶體）(3 C)。每周通過ApoTox-Glo Triplex Assay評估細胞活力、毒性和凋亡情況，7天后行Western blot分析PARP-1以區(qū)分凋亡與壞死，深入探究納米顆粒在微載體培養(yǎng)中的作用及長期影響機制。

EAhy 926細胞附著在GEM™上。用Hoechst 33342染料染色顯示了在GEM™上的細胞增殖增加（圖3 A）。此外，對線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的活性染色證明了細胞的活力（圖3 B）。細胞內(nèi)PPS的定位：細胞暴露于20 mg/ml的紅色熒光PPS以研究細胞定位。在細胞內(nèi)觀察到R25，主要定位在溶酶體中（圖3 C）。

CERO系統(tǒng)的優(yōu)勢
CERO 3D細胞類器官培養(yǎng)系統(tǒng)在細胞毒性檢測中具有顯著優(yōu)勢，其3D培養(yǎng)技術(shù)模擬體內(nèi)環(huán)境，自動化操作簡化了實驗流程，同時高精度監(jiān)測與控制功能、低剪切力設(shè)計和高效氣體傳遞能力共同為細胞提供了適宜的生長環(huán)境，維持了細胞的完整性和生理功能。此外，系統(tǒng)的可擴展性為從實驗室規(guī)模到大規(guī)模藥物研發(fā)生產(chǎn)的不同規(guī)模研究提供了便利，提高了實驗效率和可重復(fù)性，是研究納米顆粒長期影響的理想模型。

展望
研究結(jié)果表明，長期暴露于納米顆粒對細胞有顯著影響，檢測細胞毒性的濃度與暴露模型緊密相關(guān)，為安全應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)并指明研究方向。未來，優(yōu)化CERO系統(tǒng)培養(yǎng)條件，深入探究納米-細胞器互作，開發(fā)更靈敏檢測法，將全面理解納米顆粒對細胞的影響。CERO等技術(shù)助力納米技術(shù)在醫(yī)療、食品等領(lǐng)域發(fā)揮更大潛力，造福人類健康與社會發(fā)展。