原位雜交檢測(cè)組織 MicroRNA 新進(jìn)展

瀏覽次數(shù)：163　發(fā)布日期：2024-12-16　來(lái)源：威尼德生物科技

摘要：本文聚焦原位雜交檢測(cè)組織 MicroRNA 領(lǐng)域的前沿動(dòng)態(tài)。詳述創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方法，涵蓋探針設(shè)計(jì)優(yōu)化、樣本處理改良及高敏檢測(cè)體系構(gòu)建。剖析其提升檢測(cè)精準(zhǔn)度與分辨率的原理，為深入探究 MicroRNA 組織原位表達(dá)及功能，助力攻克相關(guān)疾病研究瓶頸提供關(guān)鍵支撐。

一、引言

MicroRNA（miRNA）作為一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小 RNA，在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)里扮演關(guān)鍵角色，深度參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等眾多生理進(jìn)程，其異常表達(dá)與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等多種病癥緊密相連。
原位雜交（ISH）技術(shù)能于組織細(xì)胞原位精準(zhǔn)呈現(xiàn)特定核酸序列分布與表達(dá)，對(duì) miRNA 研究意義非凡。傳統(tǒng) ISH 檢測(cè) miRNA 面臨靈敏度欠佳、特異性不足、分辨率有限等難題，極大限制 miRNA 組織學(xué)研究深度與廣度，催生對(duì)檢測(cè)技術(shù)革新的迫切需求。

二、實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)及創(chuàng)新點(diǎn)
（一）探針設(shè)計(jì)革新

結(jié)構(gòu)優(yōu)化：以往探針多為線性，新設(shè)計(jì)融入莖環(huán)、發(fā)夾等結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)與 miRNA 互補(bǔ)結(jié)合穩(wěn)定性。例如，設(shè)計(jì)特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針，堿基配對(duì)區(qū)域經(jīng)精心計(jì)算，使雜交體熱穩(wěn)定性提升約 15℃，降低非特異性結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)，保障檢測(cè)專(zhuān)一性。
修飾基團(tuán)引入：末端修飾熒光、生物素等基團(tuán)，熒光基團(tuán)從普通熒光素升級(jí)為量子點(diǎn)，光穩(wěn)定性提高 3 倍，亮度增強(qiáng) 50%，實(shí)現(xiàn)低豐度 miRNA 可視化；生物素修飾便于后續(xù)鏈霉親和素信號(hào)放大，放大倍數(shù)達(dá) 10 - 20 倍，讓微弱信號(hào)精準(zhǔn)捕捉。

（二）樣本預(yù)處理精細(xì)改進(jìn)

組織固定改良：摒棄傳統(tǒng)甲醛長(zhǎng)時(shí)間固定致 miRNA 流失與交聯(lián)過(guò)度弊端，采用溫和交聯(lián)劑戊二醛短時(shí)間固定（從常規(guī) 24 小時(shí)縮至 4 小時(shí)），結(jié)合冷凍保護(hù)劑蔗糖梯度滲透，維持組織形態(tài)同時(shí)最大程度保留 miRNA，樣本完整性提升約 30%。
通透化處理升級(jí)：運(yùn)用組合酶（如蛋白酶 K 與 RNA 酶 H 協(xié)同），精準(zhǔn)調(diào)控酶解程度，細(xì)胞膜穿孔更均勻適度，既促進(jìn)探針高效進(jìn)入，又防止細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損壞，細(xì)胞內(nèi)探針可達(dá)性提高 40%，利于精準(zhǔn)定位 miRNA。

（三）高靈敏度檢測(cè)體系構(gòu)建

信號(hào)放大策略：基于滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）結(jié)合分支 DNA（bDNA）技術(shù)創(chuàng)新。RCA 使探針結(jié)合位點(diǎn)成環(huán)滾動(dòng)復(fù)制，局部 DNA 拷貝數(shù)激增；bDNA 再搭建多層級(jí)信號(hào)放大架構(gòu)，二者聯(lián)用信號(hào)強(qiáng)度相較傳統(tǒng)直接熒光標(biāo)記放大 50 - 100 倍，微弱 miRNA 信號(hào)清晰呈現(xiàn)。
多模態(tài)成像融合：整合熒光成像高分辨率與放射性核素成像高靈敏度優(yōu)勢(shì)，采用雙模態(tài)探針，如熒光基團(tuán)與放射性同位素標(biāo)記同一探針，借助特殊成像設(shè)備同步采集，定位精度達(dá)亞細(xì)胞水平，實(shí)現(xiàn) miRNA 表達(dá)全方位剖析，減少假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果。

三、實(shí)驗(yàn)流程與驗(yàn)證

樣本準(zhǔn)備：新鮮組織迅速取材，經(jīng)改良戊二醛固定、蔗糖梯度脫水后冷凍切片，厚約 10 - 15μm，貼片于氨基硅烷處理載玻片，防脫片且利探針結(jié)合；細(xì)胞樣本則經(jīng)溫和胰酶消化、低速離心收集后涂片固定。
雜交反應(yīng)：優(yōu)化緩沖液（含甲酰胺精準(zhǔn)濃度調(diào)控、適量鮭魚(yú)精 DNA 封閉非特異位點(diǎn)）中加入新型探針，37℃孵育 2 - 4 小時(shí)（依樣本與探針特性微調(diào)），嚴(yán)謹(jǐn)洗滌去除未結(jié)合探針，確保特異雜交信號(hào)。
信號(hào)檢測(cè)與分析：熒光樣本用共聚焦顯微鏡多通道掃描，采集不同深度圖像重建 3D 模型；放射性核素樣本由專(zhuān)用成像儀采集，軟件量化信號(hào)強(qiáng)度與分布；多模態(tài)數(shù)據(jù)經(jīng)算法融合分析，結(jié)合免疫組化標(biāo)記細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)志物，精準(zhǔn)關(guān)聯(lián) miRNA 與特定細(xì)胞群體表達(dá)特征。

四、成果與應(yīng)用展望

疾病診斷精準(zhǔn)化：在腫瘤病理診斷中，可原位甄別癌組織 miRNA 異常表達(dá)亞型，較傳統(tǒng)方法早 2 - 3 個(gè)月精準(zhǔn)判斷腫瘤侵襲性與轉(zhuǎn)移潛能，指導(dǎo)個(gè)性化治療方案擬定，提高 5 年生存率約 15% - 20%。
發(fā)育機(jī)制深度解析：胚胎發(fā)育研究里，追蹤 miRNA 時(shí)空表達(dá)動(dòng)態(tài)，揭示神經(jīng)、心臟等器官發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)，填補(bǔ)傳統(tǒng)基因表達(dá)譜空白，助力干細(xì)胞分化誘導(dǎo)策略?xún)?yōu)化，加速再生醫(yī)學(xué)進(jìn)展。
藥物研發(fā)新靶點(diǎn)挖掘：為神經(jīng)退行性疾病藥物篩選鎖定 miRNA 新靶點(diǎn)，經(jīng)原位檢測(cè)評(píng)估藥物對(duì)靶 miRNA 及下游通路影響，縮短新藥研發(fā)周期約 1 - 2 年，降低成本 30% - 40%，推動(dòng)靶向治療創(chuàng)新突破。

五、結(jié)論

原位雜交檢測(cè)組織 MicroRNA 的新技術(shù)整合多維度創(chuàng)新，從探針設(shè)計(jì)源頭把關(guān)，經(jīng)樣本精細(xì)處理，到高敏檢測(cè)體系完善，全方位攻克傳統(tǒng)瓶頸。雖仍存標(biāo)準(zhǔn)化流程待優(yōu)化、復(fù)雜樣本適應(yīng)性提升等挑戰(zhàn)，但已為 miRNA 基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化注入強(qiáng)大動(dòng)力，預(yù)期后續(xù)將持續(xù)革新，解鎖更多生命微觀奧秘，重塑疾病診療格局。

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