小麥（Triticum aestivum L.）作為世界三大糧食作物之一，保障其產(chǎn)量穩(wěn)定與品質(zhì)提升對全球糧食安全至關(guān)重要。傳統(tǒng)小麥育種手段在應(yīng)對復(fù)雜環(huán)境脅迫、快速改良品質(zhì)性狀時面臨諸多局限，如育種周期冗長、遺傳資源利用受限等。基因工程技術(shù)的興起為打破這些瓶頸帶來曙光，可精準(zhǔn)導(dǎo)入有益外源基因，定向改變小麥遺傳特性。

花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)化因能避開繁瑣組織培養(yǎng)再生障礙、直接獲得轉(zhuǎn)基因種子，成為小麥轉(zhuǎn)基因研究熱點(diǎn)。電穿孔轉(zhuǎn)化法作為花粉轉(zhuǎn)化途徑之一，利用短暫高壓電脈沖使細(xì)胞膜通透性瞬時增加，促使外源 DNA 進(jìn)入細(xì)胞。然而，當(dāng)前該方法在小麥應(yīng)用中轉(zhuǎn)化效率參差不齊、鑒定流程欠規(guī)范，限制其廣泛應(yīng)用與深入發(fā)展。開展優(yōu)化小麥花粉電穿孔轉(zhuǎn)化并精準(zhǔn)鑒定轉(zhuǎn)基因植株研究，對完善小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)、加速遺傳改良進(jìn)程極具理論與實(shí)踐價值。

選用我國廣泛種植、綜合性狀優(yōu)良但在抗病或抗逆方面有待提升的小麥品種，如 “濟(jì)麥 22”“鄭麥 9023” 等，于溫室或田間常規(guī)種植管理，保障花粉發(fā)育良好、活性充沛，為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)提供優(yōu)質(zhì)材料。

電穿孔儀（具備精準(zhǔn)調(diào)控電壓、電容、脈沖次數(shù)及時長功能，誤差＜1%）、離心機(jī)（高速冷凍型，最大轉(zhuǎn)速＞15000rpm，溫控精度 ±1℃）、PCR 儀（多通道、梯度控溫，控溫精度 ±0.1℃）、凝膠成像系統(tǒng)（高分辨率、靈敏檢測微量 DNA 條帶）、核酸雜交儀（精確控溫、振蕩，保障雜交高效均勻）等，定期校準(zhǔn)維護(hù)確保性能穩(wěn)定可靠。

經(jīng)多組電穿孔參數(shù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)電壓 1000 - 1200V、電容 10 - 15μF、脈沖時長 30 - 40ms、脈沖次數(shù) 2 次組合下，花粉活力雖稍有降低（約 80%，對照 90%），但轉(zhuǎn)化效率顯著提升，經(jīng)抗性篩選后陽性愈傷率達(dá) 5% - 8%，較常規(guī)參數(shù)組合（＜2%）優(yōu)勢明顯，高電壓助 DNA 穿透，合理電容、時長與次數(shù)協(xié)同保障細(xì)胞膜適度損傷與修復(fù)，促 DNA 整合。

蛋白酶抑制劑加持的 4℃孵育預(yù)處理，花粉細(xì)胞膜完整性提升，電穿孔后膜修復(fù)加快，外源 DNA 攝取量增多，熒光定量 PCR 測轉(zhuǎn)化花粉目標(biāo)基因初始拷貝數(shù)較未處理高 2 - 3 倍，對應(yīng)后續(xù)抗性篩選植株陽性率提升約 30%，證實(shí)預(yù)處理優(yōu)化對轉(zhuǎn)化有積極增效。

PCR 檢測初篩得陽性植株比率約 10% - 15%，經(jīng) Southern blot 精準(zhǔn)鑒定，約 70% - 80% 具清晰、特異雜交條帶，確定外源基因整合，單拷貝整合占比約 40%，多拷貝整合分布規(guī)律明晰；Northern blot 顯示整合基因在多數(shù)陽性株轉(zhuǎn)錄正常，表達(dá)量與拷貝數(shù)有一定正相關(guān)，且抗病或抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)基因株系對應(yīng)性狀測試優(yōu)于對照，如耐鹽株系 0.5% NaCl 脅迫下根長、生物量比對照高 30% - 50%，表型與分子表達(dá)關(guān)聯(lián)緊密，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化與表達(dá)實(shí)效性。

本研究成功優(yōu)化小麥花粉電穿孔轉(zhuǎn)化流程，關(guān)鍵在于精細(xì)電穿孔參數(shù)匹配與花粉預(yù)處理強(qiáng)化，協(xié)同打破轉(zhuǎn)化瓶頸。在鑒定層面，多技術(shù)聯(lián)用、層層遞進(jìn)，從基因有無、拷貝數(shù)到轉(zhuǎn)錄表達(dá)、表型功能全方位解析，保障轉(zhuǎn)基因株系精準(zhǔn)甄別，解決以往鑒定單一、誤判率高問題。

與傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍轉(zhuǎn)化比，花粉電穿孔簡化流程、降低設(shè)備依賴與成本，雖仍有花粉活力損失、轉(zhuǎn)化效率待升空間，但經(jīng)優(yōu)化后差距縮小且適用特殊基因?qū)�入場景。后續(xù)可深挖電穿孔微觀機(jī)制、拓展適配基因類型，結(jié)合基因編輯技術(shù)，為小麥復(fù)雜性狀改良定制方案，持續(xù)賦能小麥遺傳育種革新。

本研究系統(tǒng)優(yōu)化小麥花粉電穿孔轉(zhuǎn)化方法，確定最佳電穿孔參數(shù)與花粉預(yù)處理?xiàng)l件，顯著提高轉(zhuǎn)化效率，結(jié)合嚴(yán)謹(jǐn)分子與表型鑒定體系，精準(zhǔn)篩選、確認(rèn)轉(zhuǎn)基因植株，為小麥功能基因挖掘、品種定向改良筑牢技術(shù)根基，預(yù)期未來在小麥優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗逆育種實(shí)踐中發(fā)揮關(guān)鍵支撐，推動產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。