圖2.稀疏和多位點熒光標記腦類器官的長期活體成像.f、4 個不同類器官（第 15 天）的 3D 投影（左）和橫截面（右），用全切片熒光原位雜交鏈反應（HCR）染色標記轉錄本。比例，100 微米。g) 從 188 小時成像實驗中 75 小時成像的最大投影圖像。類器官包含 5 種不同的細胞系，這些細胞系具有穩(wěn)定的蛋白質遺傳標記，使用紅色或綠色熒光蛋白（RFP，GFP），以及未標記的細胞。比例，100 微米。h) 組織器切片（84 小時）顯示核膜（Lamin，RFP，品紅色）、質膜標記（CAAX，RFP，品紅色）、肌動蛋白（GFP，綠色）、微管蛋白（RFP，品紅色）和細胞核（組蛋白，GFP，綠色）。i) 不同時間點的圖像顯示最大強度投影（左半部分）和切片（右半部分）。

 

每兩天更換一次培養(yǎng)基。成像使用 Viventis LS1 Live 光片顯微鏡進行，具體設置如下：

• 物鏡——25X NA1.1水鏡

• 成像視野——710μm

• xy 像素大小——0.347μm

• Z軸步徑——2μm，201 步

• 采集幀率為——30 分鐘 

 

圖4. 使用接多路多位點細胞標簽的細胞和細胞核形態(tài)轉變。a)分析策略示意圖。b) 第 6 天的類器官最大強度投影，標記有核膜（Lamin，RFP，粉色）、質膜（CAAX，RFP，粉色）、肌動蛋白（GFP，綠色）、微管蛋白（RFP，粉色）和細胞核（組蛋白，GFP，綠色）c) 解通道圖像（Lamin，深棕色；CAAX，橙色；肌動蛋白，藍色；微管蛋白，品紅色；組蛋白，綠色） d) 基于形態(tài)特征提取的所有解多通道標簽的 PAGA 初始化 UMAP 嵌入。e) PAGA 初始化 UMAP 嵌入顯示肌動蛋白、微管蛋白和 CAAX 標簽的軸長變化，以及使用組蛋白和 Lamin 分割測量的細胞核體積變化。PAGA 圖顯示平均簇年齡（天數(shù)）的變化，節(jié)點大小表示一個簇內的細胞數(shù)量，邊寬反映兩個簇之間的連接強度。f) 在 matrigel 條件下，所有細胞（肌動蛋白）按其對齊指數(shù)（與最近的類器官表面法線的絕對余弦角）著色。比例范圍為 0-1，其中 1（紅色）對應于與類器官表面垂直對齊的細胞。g) PAGA 初始化的 UMAP 嵌入和 PAGA 圖顯示使用從基質膠、無基質和瓊脂糖條件下分割的細胞的細胞形態(tài)類型聚類。圖基于提取的所有分割細胞（肌動蛋白）的形態(tài)測量。h) PAGA 初始化的 UMAP 嵌入顯示細胞軸比隨時間變化，并疊加顯示使用 PAGA 圖的平均聚類年齡。PAGA 圖根據(jù)聚類的平均年齡從淺灰色到黑色進行顏色編碼。i) 每個形態(tài)類型聚類的示例細胞（肌動蛋白）。j) 顯示標記有肌動蛋白的細胞的類器官示例圖像，顯示按其形態(tài)類型聚類著色的細胞。k) 堆疊條形圖顯示在基質膠、無基質和瓊脂糖條件下各個肌動蛋白形態(tài)類型聚類中細胞的比例。l) 圖像顯示在第 6 天基質膠條件下的細胞（肌動蛋白）根據(jù)細胞對齊指數(shù)著色，以及在第 9 天無基質和瓊脂糖條件下的細胞。m) 小提琴圖顯示在第 4 天到第 12 天所有三種條件下所有分割細胞的細胞對齊（肌動蛋白）值。n) 線圖顯示在三種條件下香農指數(shù)的變化，基于隨時間變化的每個簇的細胞數(shù)量（基質膠 (n=3)、無基質 (n=3) 和瓊脂糖 (n=3)）。

 

矩陣通過調節(jié) WNT 通路影響類器官的

形態(tài)發(fā)生和模式形成

 

為了理解在不同基質條件（基質膠、瓊脂糖、無矩陣）下生長的類器官中發(fā)展出的分子細胞狀態(tài)，我們對第 13 天的類器官進行了單細胞轉錄組分析，差異表達基因的基因本體分析顯示出多個信號通路的富集，包括WNT、Notch、FGF 和 Hippo 信號通路以及與肌動蛋白細胞骨架調節(jié)相關的基因。

基質膠誘導的神經外胚層的強烈形態(tài)變化，以及在無基質條件下 WNT 和 Hippo 信號通路的上調，測試了YAP調節(jié)對類器官發(fā)育的影響。綜合證實了我們應用含有外部基底膜豐富的 ECM 的 matrigel，導致腔體擴張并自我模式化為主要的頭側前腦區(qū)域，并且 YAP1 的激活和 WLS 表達水平的增加促進了發(fā)育中的神經上皮的尾部化。