光學(xué)成像儀器可以放大微小物體，聚焦遙遠(yuǎn)星體，揭示肉眼看不見的細(xì)節(jié)。但是，它有一個眾所周知且令人煩惱的問題：景深有限。我們的眼睛（也是一種光學(xué)成像裝置）也有同樣的困擾，但我們的大腦在信號到達(dá)意識認(rèn)知之前會巧妙地移除所有不在焦點上的信息。如果圖像保留在照片上，這種方法就不起作用了。通過優(yōu)化參數(shù)，我們可以增加焦點深度，但通常我們會失去分辨率以及z位置上的信息。

如果可能的話，我們只記錄焦點中的特征并測量相對的z位置，我們就可以解決景深問題：在記錄一系列圖像之后，我們就可以重建整個樣本而不帶模糊部分，并在所有三個維度上量化物體。
 

垂直方式——共聚焦

通常，當(dāng)我們提到光學(xué)切片時，首先想到的是共聚焦顯微鏡^[1]。共聚焦原理已經(jīng)無縫地集成到標(biāo)準(zhǔn)型光學(xué)顯微鏡中（盡管技術(shù)整合需要進(jìn)行大量的修改）。與普通光學(xué)顯微鏡不同，真正的共聚焦成像要求照亮盡可能小的單點。光斑的直徑由波動光學(xué)決定，并在d≈λ/NA時達(dá)到衍射極限最小值。詳細(xì)的強(qiáng)度分布由點擴(kuò)散函數(shù)描述。同時，探測器也必須感知盡可能小的光斑。由于光路是對稱的，同樣的數(shù)學(xué)原理也適用于點狀探測器的傳感分布。通過在檢測路徑中的中間像面引入針孔光圈來實現(xiàn)點探測器。在樣本中，照明和檢測的焦點必須重合——因此稱為“共聚焦”顯微鏡。如圖1所示，針孔的效果是光學(xué)地去除所有不是來自焦平面的光線。它的功能是在z方向上作為空間濾波器。

由于光學(xué)刀片一次僅在一個單點上工作，為了生成圖像，這個點必須從上到下逐行移動。強(qiáng)度同步轉(zhuǎn)換為數(shù)字信息，并存儲在計算機(jī)的幀存儲器中。從這種電子存儲器中，圖像在普通監(jiān)視器上顯示。由于圖像必須逐點順序構(gòu)建，因此只有在影響幀格式和接受的信噪比的一定限制下，才能實現(xiàn)高幀率。例如Leica SP探測器和混合探測器（HyDs）等高度透明的光束路徑以及非常高效的傳感器有助于提高高幀率性能。與PAL標(biāo)準(zhǔn)顯示的線頻率約為15,000 Hz相比，共聚焦顯微鏡實現(xiàn)了高達(dá)12,000 Hz的線頻率。在適當(dāng)?shù)臈l件下，每秒的幀率可能高達(dá)約500幀。盡管如此，為了獲得信噪比足夠高的圖像，幀率通常不會超過每秒10幀。

與掃描過程相關(guān)的另一個問題是，樣品中焦點平面以上和以下的區(qū)域會暴露于大量照明能量，這些能量不會貢獻(xiàn)于圖像，但可能會導(dǎo)致熒光染料的光物理降解。由于熒光染料在焦點平面以上也會吸收光，因此當(dāng)深入樣品聚焦時，熒光強(qiáng)度會變得越來越暗。這可以通過自動增益適應(yīng)來補(bǔ)償，但會降低信噪比。

真正共聚焦成像的積極方面在于其高分辨率（易于應(yīng)用高數(shù)值孔徑鏡頭）、焦點平面上的圖像本身均勻，以及共聚焦顯微鏡可以輕松分析標(biāo)準(zhǔn)制備。共聚焦顯微鏡基于標(biāo)準(zhǔn)同軸光學(xué)顯微鏡，通過簡單的切換，顯微學(xué)家可以使用所有標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡方法和對比度模式。它也是其他類型掃描顯微鏡的基礎(chǔ)，如多光子激發(fā)、高次諧波產(chǎn)生顯微術(shù)、相干反斯托克斯拉曼散射顯微術(shù)和超分辨率技術(shù)STED（受激發(fā)射損耗顯微術(shù)）。

圖1：真正共聚焦掃描顯微鏡中光路的示意圖。激發(fā)光（藍(lán)色）通過用于入射照明的分光器耦合到顯微鏡中，并通過物鏡1聚焦到衍射受限光斑。發(fā)射光通過分光器并通過針孔進(jìn)行空間過濾。在x和y方向上掃描光斑會產(chǎn)生圖像，即光學(xué)切片。

 

水平方式——光片

盡管共聚焦顯微鏡是光學(xué)切片技術(shù)的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但執(zhí)行這一任務(wù)的第一臺顯微鏡早在半個世紀(jì)前就已經(jīng)問世。這款“Spalt-Ultramikroskop”^[2]使用了一個明亮的光源（弧光燈或太陽），該光源聚焦到一個狹縫孔徑中。第二個透鏡，通常是一個再利用的物鏡，將這個狹縫正交投影到顯微鏡的光軸上的樣本中。這種設(shè)計有效地創(chuàng)建了一個厚度約為兩微米的片狀光。早期的應(yīng)用是關(guān)注亞分辨率粒子，如彩色玻璃中的分散金。后來證明它對化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中常見的各種膠體樣品和混濁介質(zhì)非常有用。這種早期的光片顯微鏡僅限于可視化小到5納米的粒子，這些粒子會引起照明的球形散射，這種散射在顯微鏡的垂直光束路徑中作為衍射圖案被觀察到。因此，它可視化的是稱為“Ultramikronen”的不可解析粒子，即“超出顯微鏡分辨率”的粒子。盡管“超顯微鏡”這個名字首先會讓人聯(lián)想到一種超分辨率類型的設(shè)計，但作者明確表示，超顯微鏡明顯受到光學(xué)衍射的限制。

 圖2：Spalt-Ultramikroskop中光路的示意圖。激發(fā)光通過物鏡1聚焦，經(jīng)過狹縫（Spalt）正交地進(jìn)入樣本。發(fā)射光被物鏡2收集，并可能由相機(jī)記錄為光學(xué)切片。

后來，人們開發(fā)了避開精密狹縫的設(shè)計，并使用了筒鏡來創(chuàng)建垂直于光軸的片狀光^[3]。這種布置隨后被用于熒光固定樣本。光片顯微鏡特別有利于對厚樣本進(jìn)行快速活細(xì)胞成像，因為漂白現(xiàn)象不太明顯，而且圖像記錄是由數(shù)字相機(jī)并行進(jìn)行的，如Huisken所示^[6]。由于照明在z方向上聚焦的所有位置都是相等的，因此z方向上的吸收不是問題。然而，發(fā)射光必須通過樣本，就像普通顯微鏡一樣，這可能會在一定程度上使厚樣本的圖像質(zhì)量變差。盡管如此，在側(cè)向方向上仍然存在陰影效應(yīng)：光首先被照明光進(jìn)入樣本的一側(cè)吸收，因此，熒光在相反的一側(cè)會變暗。Voie^[3]通過旋轉(zhuǎn)樣本并從不同方向收集圖像來補(bǔ)償這種效應(yīng)。Dodt^[7]從兩個相對的方向照射樣本，以補(bǔ)償光片的光吸收。Keller^[4]沒有使用投射的狹縫孔徑或圓柱形透鏡，而是掃描了垂直于觀察軸的細(xì)激光束。這種方案被稱為“數(shù)字掃描光片”。

 

結(jié) 合

圖3：真共聚焦掃描和垂直旋轉(zhuǎn)光片掃描的相干融合光路示意圖。詳情請參見圖1和圖2的圖例。這種配置允許在兩種光學(xué)切片模式之間無縫切換。

這兩種范例都已被引入生物醫(yī)學(xué)研究和常規(guī)流程中，為生物概念和疾病以及細(xì)胞成分的構(gòu)造和功能提供了新的見解和理解。在儀器方面，這兩種方法存在顯著差異，正交照明被視為系統(tǒng)的獨(dú)立部分，并與同軸顯微鏡結(jié)合以執(zhí)行任務(wù)。共聚焦顯微鏡使用光束掃描系統(tǒng)創(chuàng)建二維圖像，而數(shù)字掃描光片使用光束掃描從線條創(chuàng)建區(qū)域。這立即引發(fā)了一個問題，即是否有可能將這兩種策略結(jié)合到單個系統(tǒng)中。徠卡顯微系統(tǒng)（Leica Microsystems）使用STELLARIS DLS光片顯微鏡^[5]提供了這種解決方案。

STELLARIS DLS基于普通共聚焦顯微鏡，這是一種同軸掃描設(shè)備，它通過檢測針孔在空間上過濾失焦光來進(jìn)行光學(xué)切片。通過電流計掃描鏡使照明光斑在兩個側(cè)向方向上移動來生成圖像。要將這樣的系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為數(shù)字光片顯微鏡，必須使照明光束通過樣本，垂直于光軸。通過在觀察場外的焦平面位置引入一個小鏡子，可以實現(xiàn)所需的正交照明。這種偏轉(zhuǎn)鏡與觀察鏡機(jī)械連接，以確保照明的z位置始終位于圖像生成光學(xué)的焦點上，同時圖像被投射到檢測器上，將強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像。

照明光束的單個位置不會形成二維圖像，而只會形成一條線。可以利用共聚焦顯微鏡中固有的一個側(cè)向掃描模式來在垂直方向上掃描照明線，從而得到所需的二維平面。

如果在相反的一側(cè)引入第二個鏡子，就可以通過同一透鏡從兩側(cè)照射樣本——僅通過使用共聚焦顯微鏡的光束掃描設(shè)備的第二個軸。這滿足了補(bǔ)償因吸收導(dǎo)致的陰影的需要。之后的圖像隨后再由兩個不同照明方向的圖像重新構(gòu)建。

在共聚焦模式下進(jìn)行成像時，必須調(diào)整z軸驅(qū)動元件，使照明光束的焦點與要成像的特征重合。然后，掃描過程僅覆蓋視場內(nèi)部，有效抑制了焦外光，從而獲得高對比度的圖像。切換到光片采集模式時，需要將焦點移動約等于鏡面到光軸的距離。此時，光束的平面生成部分將落在觀察視場的中心。掃描裝置需要指向視場邊緣，才能照射到鏡面并生成光片。

這種組合不僅降低了儀器成本，因為兩個不同的儀器合并為一個，而且它還允許將經(jīng)典共聚焦顯微鏡和光片顯微鏡結(jié)合起來。因此，同一系統(tǒng)允許使用適合解決當(dāng)前研究問題的技術(shù)來探索任何樣本。它還為各種新的應(yīng)用機(jī)會提供了可能，因為共聚焦路徑可用于光操控，隨后通過溫和的光片成像觀察誘導(dǎo)效應(yīng)。

 

參考文獻(xiàn)：

1.Minsky M: Microscopy Apparatus. US Patent 3.013.467, filed 7th November 1957, granted 19th December 1961 (1961).

2.Siedentopf H, and Zsigmondy R: Über Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikroskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Ann. Phys. IV (10): 1–39 (1903).

3.Voie AH, Burns DH, and Spelman FA: Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microscopy 170 (3): 220–36 (1993).

4.Keller PJ et al.: Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science 322: 1065 (2008).

5.Knebel W, and Sieckmann F: Verfahren und Anordnung zur Beleuchtung einer Probe. German patent application, publication Nr. DE 10 2011 054 914 A1 (2011).

6.Huisken J et al.: Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science 305 (5686): 1007–9 (2004).

7.Dodt HU et al.: Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods 4 (4): 331–36 (2007).

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