一、介紹
鱟試劑（LAL）測(cè)定法是藥典中用于檢查藥品（如USP <85>章所述）、加工材料和藥用級(jí)水中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法。

對(duì)于任何生物測(cè)試，測(cè)試結(jié)果都容易受到分析條件變化的影響。在這里，鱟試劑測(cè)定法即使作為生物測(cè)定法，也具有相對(duì)較高的變異性^[1]。這種變化主要來自3個(gè)方面：試劑、產(chǎn)品和方法^[2]。本文以光度法（顯色法和比濁法）為重點(diǎn)，探討了造成鱟試劑檢測(cè)差異的一些原因，并研究了如何通過良好的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制來評(píng)估差異。

二、鱟試劑測(cè)試的變異性
鱟試劑檢測(cè)的不同方面都會(huì)造成差異。這些方面包括鱟試劑、內(nèi)毒素對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋誤差。我們將依次對(duì)這些方面進(jìn)行研究。

（一）鱟試劑
鱟試劑會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的差異，原因如下：
鱟試劑（鱟溶解物）來源于生物，是多種酶和輔助因子的復(fù)雜混合物。該提取物是相對(duì)粗糙的混合物，不是單一的純化酶，這意味著無法準(zhǔn)確測(cè)定每批裂解物的酶活性。

生產(chǎn)過程中會(huì)添加緩沖劑和洗滌劑，這也是造成差異的一個(gè)原因。

制造商使用美國(guó)藥典提供的參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（RSE）對(duì)每批鱟試劑的酶活性進(jìn)行評(píng)估，通過進(jìn)行2倍稀釋系列來評(píng)估鱟試劑的靈敏度。用于表征裂解液的RSE因其稀有性和昂貴性，并非所有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室都能輕易獲得，所以實(shí)驗(yàn)室通常使用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）。CSE的效力由鱟試劑供應(yīng)商根據(jù)RSE評(píng)估CSE來確定。這就增加了測(cè)試差異的可能性。

（二）細(xì)菌內(nèi)毒素
檢測(cè)中使用的內(nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致差異，這是因?yàn)椋?/span>
實(shí)驗(yàn)室中用于制備細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）的內(nèi)毒素來自純化的大腸桿菌菌株。CSE是一種高度純化的脂多糖，不含大多數(shù)可檢測(cè)的污染物（如蛋白質(zhì)）。CSE含有額外的穩(wěn)定填充劑，如淀粉、人血清白蛋白和聚乙二醇。然而，環(huán)境內(nèi)毒素未經(jīng)純化，通常以脂多糖、細(xì)胞膜蛋白和磷脂的大分子復(fù)合物的形式存在，這些物質(zhì)由革蘭氏陰性細(xì)菌在生長(zhǎng)和死亡過程中脫落。因此，根據(jù)純化內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定環(huán)境內(nèi)毒素時(shí)存在差異^[3]。

此外，盡管鱟試劑檢測(cè)對(duì)內(nèi)毒素具有特異性，但它只能檢測(cè)內(nèi)毒素分子中可用于激活裂解物的脂質(zhì)A部分（凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活，因子C通路，如下所述）^[4]。內(nèi)毒素分子的脂質(zhì)A部分可能形成未完全分散的聚集體，因此不夠均勻，無法進(jìn)行準(zhǔn)確的總測(cè)量。

因此，檢測(cè)到內(nèi)毒素的樣品不一定能顯示出樣品中的所有內(nèi)毒素，因?yàn)檫@取決于脂質(zhì)A的含量，所以檢測(cè)到內(nèi)毒素的樣品可能會(huì)被低估。此外，檢測(cè)到內(nèi)毒素的樣本在重復(fù)檢測(cè)時(shí)可能不會(huì)顯示出相同水平的內(nèi)毒素，因?yàn)殡S著時(shí)間的推移，樣本的化學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生變化，脂質(zhì)A的可用性也會(huì)隨之改變。還應(yīng)注意的是，不同類型的環(huán)境內(nèi)毒素的毒性和反應(yīng)性有所不同，這取決于脂質(zhì)A分子對(duì)不同細(xì)菌種類的生物活性。

（三）鱟試劑檢測(cè)法的變異性
鱟試劑檢測(cè)法固有的變異性為50%至200%（或每個(gè)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)兩側(cè)各有一個(gè)2倍誤差）。對(duì)于動(dòng)力學(xué)測(cè)定法，變異性源于內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率^[5]。

檢測(cè)變化可能來自一系列測(cè)試輸入，包括：
●試管
●一次性移液器吸頭
●微量移液器吸頭

針對(duì)上述情況，BET測(cè)試中使用的塑料（例如微量滴定板、塑料稀釋管）通常不是專門為內(nèi)毒素檢測(cè)而制造的。
●無菌技術(shù)
●分析技術(shù)
●移液方法的差異
●制備控制標(biāo)準(zhǔn)品的差異
●稀釋液配制過程中的變化（如果錯(cuò)誤發(fā)生在系列中的第一個(gè)稀釋中，則差異會(huì)放大）

長(zhǎng)期儲(chǔ)存的稀釋液會(huì)發(fā)生變化。可變因素包括溫度、容器成分、稀釋范圍和稀釋體積）。
●交叉污染
●產(chǎn)品或樣品干擾
●取樣容器
●樣品儲(chǔ)存時(shí)間和溫度
●LAL儀器/模塊變化——不同的儀器可能會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果
●產(chǎn)品中存在內(nèi)毒素（內(nèi)毒素分子表現(xiàn)不同或脂質(zhì)A的可用性不同）
●添加緩沖液以穩(wěn)定pH值

輔助溶液可能不含內(nèi)毒素。

上述某些問題與檢測(cè)技術(shù)人員的操作直接相關(guān)（如稀釋液的配制、移液、原材料的稱重和無菌技術(shù)等）。

（四）內(nèi)毒素濃度
隨著標(biāo)準(zhǔn)系列使用的內(nèi)毒素濃度變小，誤差的顯著性也會(huì)增加。例如，標(biāo)準(zhǔn)曲線為1.0至0.1 EU/mL時(shí)，50%至200%的誤差將比5.0至0.005 EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列產(chǎn)生的影響較小，這是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)系列中最后一個(gè)內(nèi)毒素濃度值較小。也許正是由于這些原因，藥典中列出的測(cè)試對(duì)照品的可接受加標(biāo)回收率為50%至200%。

（五）稀釋誤差
測(cè)試稀釋時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，特別是在稀釋內(nèi)毒素和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)。為避免在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)出現(xiàn)稀釋誤差，建議采取以下控制措施：

每批內(nèi)毒素或裂解物在常規(guī)使用前，應(yīng)由3名技術(shù)人員對(duì)稀釋系列進(jìn)行鑒定，每次對(duì)稀釋系列進(jìn)行3次驗(yàn)證。每個(gè)接受過該試驗(yàn)培訓(xùn)的新技術(shù)人員都要進(jìn)行類似的操作。

對(duì)于常規(guī)檢測(cè)，不同試驗(yàn)的稀釋順序不應(yīng)有差異（即，始終進(jìn)行相同類型的稀釋）。

內(nèi)毒素的起始濃度應(yīng)始終保持相同（通常為1000EU/mL）。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線是根據(jù)相同的內(nèi)毒素起始濃度（1000EU/mL）繪制的。這一點(diǎn)可通過查看生產(chǎn)商的分析證書進(jìn)行驗(yàn)證，也可通過比較使用中的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素和參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（均為大腸桿菌O113:H10的純化提取物）對(duì)生產(chǎn)商的證書進(jìn)行確認(rèn)測(cè)試。

盡管如此，在上述情況下，如果進(jìn)行測(cè)試的技術(shù)人員出了差錯(cuò)，仍有可能發(fā)生稀釋錯(cuò)誤。

（六）標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系
標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性是鱟試劑檢測(cè)的一個(gè)重要特征。線性標(biāo)準(zhǔn)曲線的y軸截距僅發(fā)生1%的變化，就會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒素測(cè)定值發(fā)生30%至35%的變化。因此，已知10EU/mL的樣品可能讀數(shù)為13.5EU/mL，這并不是因?yàn)闃悠分械膬?nèi)毒素含量發(fā)生了變化，而是因?yàn)閥-截距發(fā)生了變化�？刂茲岫确�鱟試劑檢測(cè)變異性的一個(gè)重要方法是密切關(guān)注起始（反應(yīng)）時(shí)間。這些起始時(shí)間看似微小的變化都會(huì)導(dǎo)致線性、斜率和y軸截距的變化，從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生重大影響^[6]。

三、評(píng)估差異
雖然可以采取措施減少變異，但根據(jù)良好質(zhì)量控制的原則，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有監(jiān)督和評(píng)估的手段，以確定檢測(cè)結(jié)果是否令人滿意，以及變異是否過大到足以引起關(guān)注的程度。其中一種方法就是審查變異系數(shù)（CV）。

（一）變異系數(shù)的應(yīng)用
變異系數(shù)是精確度的衡量標(biāo)準(zhǔn)。分析程序的精確度是指單個(gè)檢測(cè)結(jié)果之間的一致程度（或者，用檢測(cè)術(shù)語來說，是指當(dāng)分析程序重復(fù)應(yīng)用于單一、同體積生物基質(zhì)的多個(gè)等分試樣時(shí)，單個(gè)分析物測(cè)量結(jié)果的接近程度）^[7]。變異系數(shù)是以平均值的百分比表示的標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)不同樣本之間的平均值增加時(shí)，變異系數(shù)值就可以用來測(cè)量變異性。

通常，變異系數(shù)表示為測(cè)試重復(fù)之間的百分比（%CV）。這可以應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)和測(cè)試樣品復(fù)制。對(duì)于鱟試劑，常見的要求是CV≤10%或≤25%（取決于裂解物供應(yīng)商設(shè)定的要求）。百分比變異系數(shù)越低，說明不同測(cè)試副本之間的精確度越接近（與平均值的“散差”相對(duì)較�。�。

計(jì)算CV有不同的方法。這些方法與計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差的不同方法有關(guān)。一旦采用了標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算方法，CV就可以表示為標(biāo)準(zhǔn)差與平均值之間的比率。

由此，可以計(jì)算出%CV值：
100% ×（標(biāo)準(zhǔn)差/算術(shù)平均數(shù)）

從上式可以看出，CV轉(zhuǎn)換為百分比的方法是將得到的數(shù)字乘以100，得出%CV值^[8]。

在評(píng)估鱟試劑檢測(cè)時(shí)，根據(jù)EU/mL的測(cè)量值計(jì)算出的%CV值通常會(huì)隨著內(nèi)毒素濃度的降低而增加，因?yàn)檩^高濃度的內(nèi)毒素通�？色@得<10%的值，而較低濃度的內(nèi)毒素（通常接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的末端并接近檢測(cè)限）可獲得10%到30%的值。

在此需要指出的是，不同的鱟試劑供應(yīng)商對(duì)鱟試劑檢測(cè)有不同的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，并通過軟件包以不同的方式計(jì)算其%CV值。例如，有些供應(yīng)商根據(jù)以每毫升內(nèi)毒素單位（EU/ mL）表示的結(jié)果來計(jì)算變異系數(shù)；而有些供應(yīng)商則根據(jù)樣品的起始時(shí)間（以毫吸光為單位）來計(jì)算變異系數(shù)^[9,10]。

（二）檢測(cè)稀釋錯(cuò)誤
除變異系數(shù)外，稀釋誤差也需要評(píng)估。為了檢查鱟試劑檢測(cè)是否正確，應(yīng)檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線上內(nèi)毒素濃度最高點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間，確保其在以秒為單位的預(yù)期時(shí)間范圍內(nèi)。這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)檫@些起始時(shí)間看似微小的變化會(huì)導(dǎo)致線性度、斜率和Y-截距的變化，從而對(duì)測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生重大影響^[11]。

為此，需要檢查起始內(nèi)毒素濃度的起始時(shí)間（如5.0 EU/ml）。這需要對(duì)歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，以確定典型范圍。為了提高準(zhǔn)確性，建議對(duì)使用內(nèi)毒素進(jìn)行的前100次測(cè)試進(jìn)行評(píng)估。如果稀釋液的制備出現(xiàn)錯(cuò)誤，那么起始時(shí)間將超出預(yù)期范圍。

檢測(cè)起始時(shí)間是檢測(cè)誤差的一個(gè)重要指標(biāo)，因?yàn)樗�直接關(guān)系到光度法LAL檢測(cè)方法的工作方式。采用動(dòng)態(tài)濁度法或顯色法進(jìn)行LAL檢測(cè)時(shí)，裂解液（等分到反應(yīng)管中）會(huì)與等分樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液中的任何內(nèi)毒素發(fā)生反應(yīng)^[12]。所發(fā)生的反應(yīng)是根據(jù)時(shí)間測(cè)量濁度或顏色的變化。達(dá)到濁度閾值（在預(yù)先設(shè)定的光學(xué)范圍內(nèi)以毫吸光度單位測(cè)量）的時(shí)間越快，內(nèi)毒素濃度就越高。這一起始時(shí)間范圍不僅因內(nèi)毒素水平而異，而且不同批次的裂解液和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素也會(huì)有所不同。

起始時(shí)間必須在正確的范圍內(nèi)，因?yàn)樗�可以確定已進(jìn)行了正確的稀釋。舉例來說，如果測(cè)試的稀釋方法不正確，相關(guān)系數(shù)和報(bào)告的內(nèi)毒素值看起來仍然是正確的。這是因?yàn)橄嚓P(guān)系數(shù)是實(shí)際值與預(yù)期值之間的最佳擬合線，而軟件會(huì)解釋這些數(shù)據(jù)，并通過從標(biāo)準(zhǔn)系列中推斷出估計(jì)的內(nèi)毒素濃度^[13]。

根據(jù)平均值的第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，可以計(jì)算出起始濃度的光密度達(dá)到所需閾值所需的時(shí)間范圍。 鑒于LAL檢驗(yàn)本身存在誤差（通常認(rèn)為誤差為±25%），為了與其他生物檢驗(yàn)方法保持一定程度的標(biāo)準(zhǔn)化，第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差可以說是最合適的測(cè)量方法。標(biāo)準(zhǔn)差是衡量單個(gè)元素偏離平均值（均值）的程度。其計(jì)算公式為方差的平方根（如圖1所示）。
 

使用平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差表明95%的值落在上下限范圍內(nèi)。除此之外的5%代表非典型值。

每次LAL檢驗(yàn)完成后，記錄最高內(nèi)毒素濃度（曲線起點(diǎn)）的起始時(shí)間都要與這一范圍進(jìn)行比較，只有當(dāng)測(cè)得的起始時(shí)間在這一范圍內(nèi)時(shí)，才可認(rèn)為檢驗(yàn)是合格的。如果出現(xiàn)稀釋錯(cuò)誤，那么起始時(shí)間就會(huì)超出預(yù)期的時(shí)間范圍。

通過采用平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，任何超出計(jì)算范圍的測(cè)試值都被視為非典型值，不能代表正常人群。因此，需要對(duì)LAL測(cè)試進(jìn)行調(diào)查。作為進(jìn)一步檢查技術(shù)員工作表現(xiàn)的一種方法，區(qū)域主管可對(duì)每位技術(shù)員標(biāo)準(zhǔn)曲線的起始時(shí)間進(jìn)行趨勢(shì)分析和檢查。

（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)
還可以對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列的線性度進(jìn)行額外的檢查。為此，應(yīng)檢查每次測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（要求相關(guān)系數(shù)大于或等于0.980）。藥典要求每次測(cè)試都要進(jìn)行這項(xiàng)檢查。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性是LAL檢驗(yàn)的一個(gè)重要特點(diǎn)。線性標(biāo)準(zhǔn)曲線的Y-截距只要變化 1%，就會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒素測(cè)定結(jié)果變化30%至35%。因此，已知為10 EU/mL的樣品，讀數(shù)可能為13.5 EU/mL——這不是因?yàn)闃悠分械膬?nèi)毒素含量發(fā)生了變化，而是因?yàn)閥-截距發(fā)生了變化^[6]。

（四）陰性對(duì)照
每次檢測(cè)都應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照。陰性對(duì)照是用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的水樣。陰性對(duì)照樣品可顯示在制備內(nèi)毒素系列時(shí)是否發(fā)生了污染。對(duì)照組的內(nèi)毒素含量必須低于標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最低內(nèi)毒素濃度（常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)系列為0.05EU/mL）。這項(xiàng)檢查是藥典要求的。

四、總結(jié)
本文探討了影響 LAL 檢測(cè)的一些變化來源。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室用戶來說，了解這些因素非常重要，尤其是在設(shè)計(jì)檢測(cè)方法和調(diào)查檢測(cè)異常時(shí)。文章還考慮了一個(gè)衡量變異性的關(guān)鍵指標(biāo)：變異系數(shù)。這是實(shí)驗(yàn)室主管在審查測(cè)試結(jié)果時(shí)需要進(jìn)行的一項(xiàng)重要檢查。

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