高效液相色譜（HPLC）是近30年發(fā)展起來的一種具有高靈敏度、高選擇性的高效快速分離分析技術。它既能用于微量組分的分析測定，又能用于大量的制備分離，靈活多樣，其應用范圍已超過其他各種分離方法，尤其在中藥樣品的分析分離方面更充分發(fā)揮它的特長，為推動該領域的進步和發(fā)展作出了巨大貢獻。

高效液相色譜在使用過程中常會出現(xiàn)一些影響分析結(jié)果的問題，如果使用人員了解常見問題及其成因和相關解決方法，就能做到早預防勤維護，使分析結(jié)果保持較好的穩(wěn)定性與較高的精確性。

高效液相色譜儀系統(tǒng)組成：液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進樣器、柱子、柱溫箱、檢測器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。對于整個系統(tǒng)而言，柱子、泵和檢測器是核心部件同時也是易出問題的主要部位。

高效液相作為一種高精密儀器，如果在使用過程中不按照正確操作的話，就容易導致一些問題。其中最常見的就是柱壓問題、漂移問題、峰型異常問題。

柱壓問題
柱壓問題是使用高效液相色譜儀過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個恒定值而是指壓力波動范圍在50 PSI（3.3 Bar）之間（在使用梯度洗脫時，柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的）。壓力過高、過低都屬于柱壓問題。

壓力過高
這是高效液相色譜儀在使用中最常見的問題，指的是壓力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時，我們應該分段進行檢查。
1）首先斷開真空泵的入口處，此時PEEK管里充滿液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。
處理方法：用30%的硝酸浸泡半個小時，在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過濾頭正常，再檢查；

2）打開Purge閥，使流動相不經(jīng)過柱子，如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。
處理方法：將過濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個小時。如果壓力降至100 PSI（6.7 Bar）以下，過濾白頭正常，再檢查；

3）把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。
處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強保留的物質(zhì)導致堵塞，則要用比現(xiàn)在流動相更強的流動相沖至壓力正常。假如按上面的方法長時間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進出口反過來接在儀器上，用流動相沖洗柱子。這時，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。

壓力過低
1）壓力過低的現(xiàn)象一般是由于系統(tǒng)泄漏，處理方法：尋找各個接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可；
2）當然還有一個原因就是泵里進了空氣，但此時表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn)，忽高忽低，更嚴重一點會導致泵無法吸上液體。處理方法：打開Purge閥，用3~5 ml/min的流速沖洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。

漂移問題
主要包括基線漂移和保留時間漂移。

基線漂移
一般說來，機器剛起動時，基線容易漂移，大概要半個小時的平衡時間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長下（220 nm）平衡時間相對會比較長，但如果你在實驗過程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：
1）柱溫波動。解決方法：控制好柱子和流動相的溫度，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱；
2）流通池被污染或有氣體。解決方法：用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池（最好斷開柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）；
3）紫外燈能量不足。解決方法：更換新的紫外燈；
4）流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。
解決方法：檢查流動相的組成，使用高品質(zhì)的化學試劑及HPLC級的溶劑；
5）樣品中有強保留的物質(zhì)（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。
解決方法：使用保護柱，如有必要，在進樣之間。在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子；
6）檢測器沒有設定在最大吸收波長處。解決方法：將波長調(diào)整至最大吸收波長處；
7）流動相的PH值沒有調(diào)節(jié)好。解決方法：加適量的酸或堿調(diào)至最佳PH值。

保留時間漂移
保留時間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個重要標志，同一種東西，兩次的保留時間相差不要超過15 s，超過了半分鐘可看做保留時間漂移，就無法進行定性，你要考慮以下原因：
1）溫控不當。解決方法：調(diào)好柱溫，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱；
2）流動相比例變化。解決方法：檢查四元泵的比例閥是否有故障；
3）色譜柱沒有平衡。解決方法：在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱；
4）流速變化。解決方法：重新設定流速 ；
5）泵中有氣泡。解決方法：從泵中除去氣泡 。

峰形異常問題
峰型問題是液相的主要問題，在做液相過程中，我們就是要變換不同的條件來改善不好的峰型，對于各種各樣的異常峰，要區(qū)別對待，從主要問題出發(fā)，一個一個加以解決。
1）色譜圖中未出峰。解決方法：系統(tǒng)未進樣或樣品分解；泵未輸液或流動相使用不正確；檢測器設置不正確；針對以上情況成因作相應調(diào)整即可。
2）一個峰或幾個峰是負峰。解決方法：流動相吸收本底高；進樣過程中進入空氣；樣品組分的吸收低于流動相。
3）所有峰均為負峰。解決方法：信號電纜接反或檢測器輸出極性設置顛倒；光學裝置尚未達到平衡。
4）所有峰均為寬峰。解決方法：系統(tǒng)未達到平衡；溶解樣品的溶劑極性比流動相差很多；色譜柱尺寸及類型選擇不正確；色譜柱或保護柱被污染或柱效降低；溫度變化造成的影響。
5）所出峰比預想的小。解決方法：樣品黏度過大；進樣品故障或進樣體積誤差；檢測器設置不正確；定量環(huán)體積不正確；檢測池污染；檢測器燈出現(xiàn)問題。
6）出現(xiàn)雙峰或肩峰。解決方法：進樣量過大；樣品濃度過高；保護柱或色譜柱柱頭堵塞；保護拄或色譜柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
7）前伸峰。解決方法：進樣量或樣品濃度高；溶解樣品的溶劑較流動相極性強；保護柱或色譜柱污染或失效。
8）拖尾峰。解決方法：柱超載，降低樣品量；增加柱直徑采用較高容量的固定相；峰干擾，對樣品進行清潔過濾；調(diào)整流動相；硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相pH值；柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼；加在線過濾器，對樣品進行過濾；死體積或柱外體積過大，將連接點降至最低；盡可能使用內(nèi)徑較細的連接管；柱效下降，更換柱子；采用保護柱，對柱子進行再生。
9）出現(xiàn)平頭峰。解決方法：檢測器設置不正確；進樣體積太大或樣品濃度太高。
10）出現(xiàn)鬼峰。解決方法：進樣閥殘余峰，在每次進完樣后用充足的時間來平衡和清洗系統(tǒng)；樣品中存在未知物，改進樣品的預處理；流動相污染，更換新流動相，盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，隔夜的流動相再次使用時要過濾；盡可能使用HPLC級試劑；流路中有小的氣泡，打開Purge閥，加大流速排除。

以上內(nèi)容只是對液相色譜中出現(xiàn)的常見的問題進行了分析，在故障排除時要遵守以下原則：（1）一次只改變一個因素，確定假定因素與問題之間的聯(lián)系；（2）如果通過更換組件來排查故障時要注意將拆下的完好組件裝回原位，避免浪費；（3）養(yǎng)成良好的記錄習慣，這是成功進行故障排除的關鍵。

總之，在使用高效液相色譜時一定要注意樣品的前處理與儀器的正確操作和保養(yǎng)。
在日常的使用過程中，儀器條件經(jīng)常變化，色譜柱經(jīng)常拆卸，因此需要對色譜儀經(jīng)常檢定以發(fā)現(xiàn)儀器性能的變化。但有不少實驗人員因為不熟悉儀器的結(jié)構原理，不甚了解儀器的技術指標對分析測定結(jié)果的影響，而不能將儀器調(diào)整到最佳狀態(tài)，從而直接影響到所測定數(shù)據(jù)的準確性。

如果實驗人員能注意檢定液相色譜儀的一些問題，則會大大延長儀器的使用壽命，并使儀器的性能得到最大限度的發(fā)揮。下面，我們重點討論液相色譜儀檢定中常見的幾個影響因素以及解決問題的方法：

氣泡
由于HPLC系統(tǒng)中氣泡的存在，會造成色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪聲峰，嚴重時會造成分析靈敏度下降；氣泡變大進入流路或色譜柱時會使流動相的流速變慢或不穩(wěn)定，使基線起伏。

造成上述現(xiàn)象的主要原因有三條：一是流動相溶液中往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡；二是系統(tǒng)開始工作時未能將流路中的空氣驅(qū)趕干凈；三是在注入樣品時不注意混入了空氣。

為了避免這類問題的出現(xiàn)，HPLC實際分析過程中必須重視對流動相進行脫氣處理；在HPLC系統(tǒng)開始工作前，可以用注射器連接恒流泵的排空閥，抽入流動相，將流路中的空氣驅(qū)趕干凈；在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣。

柱溫
在操作HPLC時，色譜柱是在室溫環(huán)境下工作的。大多數(shù)的工作環(huán)境溫度是不斷變化的，溫度的差別就會引起較復雜的問題。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的，HPLC方法中的洗脫方式受溫度的影響。
1）等度洗脫時溫度會影響保留時間。當溫度升高時所有的色譜峰都前移了，等度洗脫時一般溫度每升高1℃，保留時間會縮短（1~3）%。
2）溫度變化對梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢是一樣的，但是對梯度洗脫的影響要小于對等度洗脫的影響。即便如此，若梯度洗脫時不控制溫度的話，保留值一般也會有較大的變化。
3）溫度變化還可能引起選擇性顯著變化。
正如柱子不能完全平衡將導致保留時間的重現(xiàn)性差一樣，柱溫不平衡也會導致不理想的后果，這個問題在峰寬上的影響尤其明顯。當溫度變化時除了選擇性和保留時間的變化之外，峰寬也會發(fā)生變化。升高溫度通常會使理論塔板數(shù)升高，峰寬變窄，由于峰面積不變，峰越窄就會越高，因此升高溫度可以達到更小的檢測限。
4）柱子里的溫度變化也會影響峰形。當流動相和柱子之間的溫差增大時，由溫度不平衡而導致的峰變形就會加劇。
為了獲得一致的結(jié)果我們必須要控制柱溫，使用柱溫箱是最好的辦法。如果沒有柱溫箱，最有效的辦法就是將色譜柱隔絕在一個溫度波動最小的地方。

色譜柱污染
色譜柱污染會引起保留時間漂移。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾并吸附流動相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可能是：流動相本身，流動相容器，連接管、泵、進樣器和儀器密封墊，以及樣品等。

樣品中如果存在色譜柱上保留很強的組分，就可能使保留時間漂移。通常樣品中的強保留組分具有較高的分子量，在此情況下，保留時間漂移的同時或其后會有反壓的增加�？梢酝ㄟ^使用固相提取等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響。

避免色譜柱污染最簡單的方法是防患于未然。相比之下，找到問題的所在并設計有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多。通常使用在給定色譜條件下的強溶劑，但并非所有污染物都可以在流動相中溶解。使用保護柱是個非常有效的方法。反沖色譜柱僅是不得已時采用的辦法。

色譜柱平衡
如果我們觀察到保留時間漂移，首先應考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10~20個柱體積的流動相。但如果在流動相中加入少量添加劑則需要相當長的時間來平衡色譜柱。需要柱子的充分平衡，然后才能對HPLC進行檢定。

流動相有機溶劑
流動相有機溶劑可能影響HPLC的檢測限。分析中要求使用HPLC純的試劑，關鍵是兩點：純度高、紫外吸收小。

純度高，是希望沒有雜質(zhì)干擾HPLC分析；不會有金屬離子損害純度為99.99%以上的高純度硅膠基質(zhì)。

可以通過重蒸分析純?nèi)軇�；或濾膜過濾，并定期把前置的過濾頭取下，放稀硝酸里清洗，再用純水洗至中性。

柱壓
柱壓過高是HPLC分析中常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題。
1）溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升，應更換柱子入口篩板；
2）泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進行脫氣處理；
3）比例閥失效，應更換比例閥；泵密封墊損壞，應更換密封墊；系統(tǒng)檢漏，則找出漏點，密封即可。

HPLC分析中，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下，峰形應對稱而尖銳。充分考慮到可能影響分析結(jié)果的因素，可以科學地進行液相色譜儀的檢定。