電穿孔效率受到多個關(guān)鍵因素的影響，這些因素在實驗中需要仔細考慮和控制。

外加電場的強度是影響電穿孔效率的重要因素。如果電壓過低，細胞的質(zhì)膜改變不足以讓DNA通過；反之，電壓過高則會對細胞造成不可逆的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，對于大多數(shù)哺乳動物細胞系，當(dāng)電壓在250~500V/cm范圍內(nèi)時，可以觀察到最高的瞬時表達水平。然而，即便在這樣的電壓條件下，電穿孔后通常也只有20%到50%的細胞能夠存活。

電脈沖時間的長短也是一個關(guān)鍵參數(shù)。電脈沖的持續(xù)時間、電場形狀和強度受到電源容量和電穿孔杯尺寸的限制。大多數(shù)電穿孔裝置允許研究者根據(jù)需要調(diào)整脈沖參數(shù)。在電脈沖形狀的選擇上，電穿孔儀通常提供指數(shù)衰減波和方形波兩種選項。

溫度也是一個需要考慮的因素。有些研究表明，在電穿孔過程中將細胞維持在室溫可以獲得最高的瞬時表達水平；而另一些研究則發(fā)現(xiàn)在0C條件下可以獲得更好的結(jié)果。這種差異可能是由于不同細胞類型或電穿孔過程中產(chǎn)生的熱量不同所致。特別是在使用高電壓和長時間電脈沖時，產(chǎn)生的熱量可能會更多。

DNA的構(gòu)象和濃度也對電穿孔效率產(chǎn)生顯著影響。雖然線性和環(huán)狀DNA都可以通過電穿孔進行轉(zhuǎn)染，但線性DNA通常能夠?qū)崿F(xiàn)更高的瞬時表達和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化水平。同時，DNA的濃度也需要控制在一定范圍內(nèi)，通常在1~40μg/mL之間可以獲得高效的轉(zhuǎn)染。此外，質(zhì)粒的純度也是影響電穿孔效率的關(guān)鍵因素。

培養(yǎng)基的離子成分同樣不能忽視。研究表明，使用緩沖鹽溶液（如HEPES鹽緩沖液）懸浮細胞進行電穿孔，其轉(zhuǎn)染效率要高于使用含有非離子物質(zhì)（如甘露糖或蔗糖）的緩沖液。

細胞的生理狀態(tài)也對電穿孔效率有著重要影響。生長活躍、狀態(tài)健康、無污染且低代次的細胞通常能夠獲得最佳的轉(zhuǎn)染效果。

要想提高電穿孔效率，需要綜合考慮電場強度、電脈沖時間、溫度、DNA構(gòu)象和濃度、培養(yǎng)基離子成分以及細胞生理狀態(tài)等多個因素，并進行合理的控制和調(diào)整。