結(jié)合動力學檢測是開發(fā)和表征蛋白類藥物的一個組成部分。目前結(jié)合動力學的常用技術(shù)包括基于BLI和SPR的表面固定測量技術(shù)。表面固定測量技術(shù)具有諸多難點，比如表面化學成分需要優(yōu)化、非特異結(jié)合、需要純化樣本等。

在這里，我們提出了一種新的溶液內(nèi)測量方法（FIDA），僅使用納升到微升的樣品測量結(jié)合動力學。該方法可以應用于任何緩沖液條件或基質(zhì)環(huán)境中的蛋白相互作用。它易于設(shè)置，測量分析可全自動化完成。

FIDA，(Flow Induced Dispersion Analysis) 即流體誘導分散分析，基于毛細管中層流運動的分析方法，當樣品通過毛細管時，由于毛細管中心和毛細管壁之間速度不同，毛細管中心速度快，毛細管邊緣速度慢，樣品流動呈拋物線剖面。不同的拋物線剖面（圖1.A）決定了信號曲線的形狀（圖1.B），結(jié)合斯托克愛因斯坦方程和泰勒分散公式，以此實現(xiàn)對分子粒徑（size，流體力學半徑R_h）“第一性原理（first principle）”測量。FIDA的流體動力學半徑測量廣泛適用于生物分子穩(wěn)定性、構(gòu)象變化、相互作用等方面的研究。
 

 

圖1 FIDA基本原理。A. 樣品在毛細管中分散分布示意，橫截面輪廓形狀取決于帶有熒光的分子大小或其與配體形成的復合物大��；B. 信號峰：樣品流經(jīng)檢測器時產(chǎn)生；C-D. 擴散系數(shù)D和流體力學半徑R_h計算，擬合可得到分子互作親和力K_D值等。

除了結(jié)合動力學（K_on和K_off）之外，F(xiàn)IDA還可測量平衡結(jié)合常數(shù)（K_D）和流體動力學半徑（R_h）。使用FIDA方法獲得的數(shù)據(jù)與SPR非常吻合。
 

圖 2 親和體與利妥昔單抗相互作用示意圖；親和體作熒光標記。

FIDA溶液動力學檢測

圖3：FIDA溶液內(nèi)動力學的檢測流程

· 該指示劑(indicator)與微流控毛細管內(nèi)的分析物(analyte)混合。指示劑/分析物混合物在壓力驅(qū)動下流過毛細管，當通過探測器時記錄熒光信號。
· 檢測時間隨使用壓力（圖3a）改變。
· 指示劑的信號擬合曲線隨濃度、動力學常數(shù)和 K_D （圖3b） 而變化。
· Fidabio數(shù)據(jù)分析軟件模塊擬合數(shù)據(jù)以確定動力學速率常數(shù)（圖3c）。

FIDA和SPR蛋白-蛋白互作動力學數(shù)據(jù)比較

· K_D(FIDA) 測量使用FIDA儀器480nm熒光檢測模塊，采用pre-mix分析模式。
· K_on(FIDA)與K_off(FIDA)測量采用cap-mix模式。
· SPR數(shù)據(jù)采用BiacoreX100平臺測量。
· 各平臺測試，均使用PBS緩沖液。

FIDA溶液內(nèi)動力學檢測亮點
1. 溶液中檢測，nL-uL樣品，無需表面固定
2. 快速分析方法開發(fā)----即使復雜樣品基質(zhì)
3. 實時R_h（結(jié)合化學計量比）測量，熒光強度和每個數(shù)據(jù)點質(zhì)控參數(shù)
4. 動力學：5-10s到數(shù)小時
5. 快速K_off測定----無需表面再生