脂肪細(xì)胞作為重要的能量儲(chǔ)存庫，能有效地將多余的卡路里轉(zhuǎn)化為脂肪，以滿足機(jī)體的能量需求。然而，過多的脂肪積累會(huì)導(dǎo)致肥胖，這是現(xiàn)代社會(huì)中與各種健康問題相關(guān)的一種狀況^[1]。除了在新陳代謝中發(fā)揮作用外，脂肪細(xì)胞還通過利用瘦素和脂聯(lián)素等激素影響免疫反應(yīng)和生殖功能^[2]。
脂肪形成的過程，即前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞的過程，在不同物種之間是不同的。此外，體內(nèi)組織和體外細(xì)胞中發(fā)生脂肪形成的細(xì)胞比例也不同^[3]。研究人員正在積極探索脂肪形成的相關(guān)因素以及這一復(fù)雜過程背后的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制。  
    由Sylvia P. Poulos發(fā)表的一篇綜述中表明，細(xì)胞的分化率隨培養(yǎng)基成分的不同而不同。此外，與脂肪形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平也隨著時(shí)間的推移而變化。因此，評(píng)估不同時(shí)間點(diǎn)的脂肪形成程度是至關(guān)重要的。使用全自動(dòng)活細(xì)胞成像設(shè)備，如Celloger^® Pro，可以方便地監(jiān)測和測量脂肪生成。  
    以下內(nèi)容便詳細(xì)介紹了通過Celloger^® Pro來研究前脂肪細(xì)胞系3T3-L脂肪生成的方法。
 
設(shè)備實(shí)拍：
    脂肪細(xì)胞的分化過程受到多種因素的高度調(diào)控和影響，包括前脂肪細(xì)胞的環(huán)境和藥物干預(yù)^{[4、5、6]}。其中，誘導(dǎo)分化時(shí)的細(xì)胞融合度被認(rèn)為是影響脂肪細(xì)胞形成效率和質(zhì)量的關(guān)鍵參數(shù)^[7]。此外，藥物制劑如羅格列酮，一種過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARγ)的強(qiáng)效激動(dòng)劑，已被證明在調(diào)節(jié)脂肪形成中發(fā)揮重要作用^{[8、9、10、11、12]}。
    因此，為了評(píng)估細(xì)胞初始密度如何影響脂肪細(xì)胞的分化，我們以四種不同密度播種3T3-L1細(xì)胞。此外為了確定羅格列酮對(duì)分化過程的影響，將實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組是含有羅格列酮的DM，另一組是不含羅格列酮的DM(圖3)。
    本次研究以下圖為實(shí)驗(yàn)流程圖，圖內(nèi)詳細(xì)標(biāo)注了各項(xiàng)處理因素以及處理時(shí)間點(diǎn)。  

• 確定細(xì)胞融合度

    以四種不同密度播種3T3-L1細(xì)胞。在接種的第三天，我們使用Celloger^® Pro獲取細(xì)胞圖像來驗(yàn)證融合程度，該功能會(huì)在指定日期自動(dòng)捕獲細(xì)胞圖像(圖4a)。然后使用Celloger分析軟件分析這些捕獲的圖像，以確定融合程度(圖4b)。  

• 觀察細(xì)胞形態(tài)變化

    在實(shí)驗(yàn)過程中，我們使用配備4X或10X鏡頭的Celloger^® Pro每隔一小時(shí)捕獲細(xì)胞圖像，驗(yàn)證脂肪形成過程中的細(xì)胞形態(tài)的變化。我們?cè)谝�入含有羅格列酮的DM II后立即觀察到脂滴形成的時(shí)間。細(xì)胞主要進(jìn)化成棕色脂肪樣細(xì)胞，有許多微小的脂滴。使用帶有10X鏡頭的Celloger^® Pro，我們可以清楚地識(shí)別直徑超過3 μm的脂滴為清晰的水滴狀圖形，無需進(jìn)一步染色。 該Time-lapse顯示DM II和羅格列酮處理后1小時(shí)至36小時(shí)每間隔1小時(shí)拍攝的圖像 (使用10倍放大，裁剪圖像)
 

• 觀察脂滴形成與脂滴定量

    Oil Red O試劑常用于染色脂滴來評(píng)估脂肪細(xì)胞的分化水平，但該染色方法在生理?xiàng)l件下是不可行的，很難追蹤隨時(shí)間細(xì)胞發(fā)生的變化。因此，我們選擇了LipiDyeII，一種適用于活細(xì)胞的熒光染料。LipiDyeII不僅可以染色脂滴，還可以在活細(xì)胞中進(jìn)行分析，使過程更加簡單。使用LipiDyeII染色可以觀察到，細(xì)胞逐漸形成脂滴，以綠色熒光為特征。同時(shí)，熒光信號(hào)與明場圖像中觀察到的包膜結(jié)構(gòu)精確吻合(圖6)。即使脂滴在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中被遮蔽(圖6中箭頭所示)，或者在亮場中太小而無法區(qū)分(圖6中虛線圈所示)，它們也可以很容易地使用熒光識(shí)別。  
    我們通過測量熒光覆蓋率來量化分化率，熒光覆蓋率表示脂滴所占的比例(圖7)。由于分化不是均勻地發(fā)生在整個(gè)平板上，因此有必要檢查廣泛的區(qū)域進(jìn)行綜合分析。然而，使用低倍率(如2X)不足以精確測量小脂滴。因此，通過Celloger^® Pro的拼接功能，我們可以在更寬的范圍內(nèi)測量脂滴的比例，獲得更可靠的數(shù)據(jù)。
    圖8顯示了添加或不添加羅格列酮DM II后第13天(圖8a)和整個(gè)5天期間(從第8天到第13天)(圖8b)觀察分析到的結(jié)果。羅格列酮顯著提高了脂肪細(xì)胞的分化率，熒光區(qū)增強(qiáng)表明脂肪堆積增加。未使用羅格列酮的DM II細(xì)胞在120小時(shí)后的分化率僅為4.7%。相反，用羅格列酮培養(yǎng)DM II細(xì)胞，細(xì)胞分化迅速增加，在97小時(shí)內(nèi)細(xì)胞分化率達(dá)到16.6%。但不同濃度的細(xì)胞分化程度差異不大。  
結(jié)論：
    脂肪形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多種因子的表達(dá)水平調(diào)控。理解這些復(fù)雜的機(jī)制需要長時(shí)間的細(xì)致觀察。傳統(tǒng)方法是，研究人員通過在分化過程中的特定時(shí)間點(diǎn)評(píng)估特定標(biāo)記物的表達(dá)水平。然而，Celloger^® Pro系統(tǒng)能夠?qū)�這些通路進(jìn)行連續(xù)、長期的監(jiān)測，徹底改變了費(fèi)時(shí)費(fèi)力的傳統(tǒng)監(jiān)測方法。利用延時(shí)成像功能，研究人員可以在不受時(shí)間限制的情況下進(jìn)行長時(shí)間的觀測，從而提高實(shí)驗(yàn)效率。Celloger^® Pro的一個(gè)顯著特點(diǎn)是其拼接功能，保證既能清晰觀察脂滴的形成又能捕獲大范圍的圖像區(qū)域，以評(píng)估整體脂肪細(xì)胞分化。此外，通過對(duì)脂滴進(jìn)行熒光染色，并利用Celloger^®的分析軟件測量熒光強(qiáng)度，研究人員可以量化分化程度，為觀察到的變化提供數(shù)值。Celloger^® Pro的應(yīng)用為研究脂肪細(xì)胞分化的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制提供了新的研究方法，促進(jìn)了我們對(duì)脂肪形成及其在代謝健康中的關(guān)鍵作用的理解。

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