區(qū)別3D生物打印與其他3D細胞培養(yǎng)技術的一個關鍵特征是其對創(chuàng)建結構的精確控制。這種特性 允許高分辨率制造具有可控結構和機械性能(如孔隙度、滲透性和剛度)的仿生結構。然而，分析打印  后的細胞動力學并優(yōu)化其在3D制造環(huán)境中的功能只能通過反復試驗和復制幾個實驗來實現(xiàn)。這個問題 促使了細胞自動機模型的首次開發(fā)，以模擬3D生物打印結構中的打印后細胞行為。為了改進我們的模 型，我們使用MDA–MB–231細胞負載水凝膠生物打印了一個3D結構，并在11天內評估了細胞功能，包 括活力和增殖。結果表明，我們的模型成功地模擬了生物3D打印結構，并捕獲了體外觀察結果。我們 證明了該硅模型可以預測和闡明不同初始細胞數(shù)量的生物鏈接和不同的生物鏈接配方的明膠和海藻酸 鹽打印后的生物學功能，而無需重復幾個昂貴和耗時的體外測量。我們相信這樣的計算框架將極大地 影響3D生物打印的未來應用。我們希望這項研究能夠激勵研究人員進一步認識到如何利用硅模型來推 進體外3D生物打印研究。

三維（3D）生物打印是新興的3D生物制造方法之一，它被廣泛應用于再生醫(yī)學和組織工程中， 以制造復雜的模擬組織結構1。該技術在個性化治療中具有巨大的應用潛力，更側重于控制藥物釋放、癌癥治療藥物篩選、研究可能的副作用以及分析腫瘤細胞的轉移和侵襲2 。3D生物打印技術將細胞、生 物材料和受控運動系統(tǒng)結合起來，開發(fā)復雜的3D結構，并對結構的力學性能、孔隙度、滲透性和剛度 等特征進行精確控制3 –5。該技術通過結合細胞棲息地的重要方面，可以克服傳統(tǒng)3D方法的多個限制。這些方面包括類似于腫瘤的天然細胞外基質(ECM)的非均勻3D微環(huán)境，細胞與鄰近細胞和局部ECM 的 復雜相互作用，以及營養(yǎng)物質和氧氣的復雜擴散過程6– 8。因此，這種方法可以更好地代表細胞生長機  制的見解，并提供體內腫瘤動力學和癌細胞對治療反應的更緊密預測7。盡管3D生物打印技術發(fā)展迅速，但仍有一些挑戰(zhàn)需要解決。目前，生物打印技術主要是在試錯 的基礎上實現(xiàn)預期的輸出，增加了對實驗技術的需求。這種反復試驗的基礎包括優(yōu)化生物墨水的性能 及其印刷性、結構機械強度和打印期間和打印后的細胞活力9。因此，優(yōu)化生物打印相關的實驗是非常 昂貴的。這些挑戰(zhàn)使得實驗設計和數(shù)據(jù)收集在這個過程中變得更加復雜。


圖1所示。本研究涉及的主要步驟示意圖；步驟1：制備由明膠、海藻酸鹽和MDA-MB-231細胞系組成 的生物鏈；步驟2：打印和交聯(lián)承載細胞的3D結構；步驟3：進行印后體外檢測；步驟4：開發(fā)和校準 一個硅模型。

本研究中提出的基于主體的模型有利于展示復雜的細胞系統(tǒng)，包括細胞增殖、運動、細胞與環(huán) 境的相互作用（例如，ECM、鄰近細胞和資源消耗）以及支架內的細胞聚集。在這項研究中，我們證  明了數(shù)學模型和計算機模擬可以用來捕捉體外動力學。這種體外和芯片研究的結合可以提高研究人員 對3D生物打印結構中細胞活動的理解，從而加速和提高優(yōu)化和實驗設置的準確性。所提出的硅模型是 非常有前途的，并能夠進一步發(fā)展，應用于3D細胞培養(yǎng)使用生物打印技術在不同的生物醫(yī)學應用。

結果與討論
體外細胞研究。成功打印出腫瘤樣水凝膠網(wǎng)絡模型（圖2a）。為了確定包埋在水凝膠中的MDA-MB-  231細胞的增殖情況，采用MTT法監(jiān)測細胞在第0、4、7、10和11天的代謝活動。如圖2b所示，與第0天 相比，3D細胞/水凝膠構建的MDA-MB-231細胞在第4、7、10和11天分別表現(xiàn)出1.86倍、2.7倍、2.78倍 和2.8倍的增殖。確實，細胞在前7天表現(xiàn)出快速增殖，從第7天到第11天幾乎保持了幾乎穩(wěn)定的細胞  增殖。有趣的是，結果表明，在3D微環(huán)境中封裝的MDA-MB-231的倍增時間比在2D培養(yǎng)中生長的細胞高 3倍，這可以歸因于3D基質中細胞活性的降低22。從第7天到第11天，增殖細胞的數(shù)量大致保持不變，留下了一個問題:細胞是死亡還是由于不希望的條件進入非增殖期（靜止期）。為了回答這個問題， 在11天的時間里，我們進一步采用了活死實驗和Ki-67免疫染色，以更好地了解包裹在3D支架中的細 胞行為生長采用活死染色法觀察MDA-MB-231 在11天內的生存能力，結果與 MTT試驗結果。如圖2所示，打印 后大部分細胞都能存活，第0天細胞存活率為76±2%，這清楚地表明生物打印過程對細胞活力的損害  較小。第1周存活率逐漸提高，第4天和第7天分別達到98±1%和99±1%。因此，該結構具有足夠的多  孔性，使氧氣和葡萄糖能夠通過水凝膠支架擴散和分布，為細胞提供適宜的生存環(huán)境。從第7天到第1 1天，雖然有部分細胞死亡，但大部分細胞存活，第11天存活率達到96±2%。通過對比活死實驗和MTT 實驗的結果，可以得出結論，在支架達到最大容量的7天后，有相當一部分細胞進入了靜息期，部分  細胞在長期靜息期開始死亡，或者是由于缺乏資源。本實驗中的細胞死亡幾乎可以忽略不計，這說明 明膠/海藻酸鹽支架在生物打印中的應用前景廣闊。

為了觀察MDA-MB-231的增殖能力，將細胞固定，并使用抗Ki-67抗體在共聚焦顯微鏡下對增殖細 胞進行成像（圖3，4）。Ki-67是一種常用的標記物，在細胞周期的所有活躍階段都存在，但在細胞  的固定階段則不存在23。結果表明，在第0天和第4天，ki-67的陽性細胞分別接近98±1%和95±2%，而 在第7天，這一數(shù)字下降到86±2%，然后在第11天急劇下降到約48.2±2.4。這一結果與前面的數(shù)據(jù)一 致（圖3），說明在7天內，細胞不僅存活，而且保持了增殖能力。從第7天到第11天，盡管有很大比  例的細胞存活，但由于缺乏足夠的細胞增殖空間，它們處于靜止狀態(tài)，無法再增殖。此外，在第7天  和第11天，細胞變得更加聚集，特別是靠近毛孔，細胞聚集中心的細胞由于被其他細胞包圍而顯示出 不增殖。因此，由于沒有足夠的空間放置子細胞，并且由于聚集體中心缺乏營養(yǎng)和氧氣，增殖過程被 中止。

將體外實驗結果用于參數(shù)化所建立的數(shù)學模型。

圖2 。(A)：利用生物3D打印技術制備細胞/水凝膠結構；(B)：從第0天到第11天，MDA-MB-231在水 凝膠網(wǎng)絡中包埋的增殖。誤差條表示±SD, n≥3。

結論
到目前為止，在3D生物打印水凝膠中生長的細胞的最佳打印后行為僅通過復制幾個實驗實現(xiàn)，這些實 驗既耗時又昂貴。為了克服這一挑戰(zhàn)，我們開發(fā)了一個CA模型來模擬3D生物打印結構中的打印后細胞 動力學。為此，我們首先成功地打印了MDA-MB-231/明膠/海藻酸鹽生物鏈接，并在11天內使用MTT,

Live-dead和Ki-67細胞增殖試驗評估了細胞行為。利用體外實驗結果，我們在CA模型中定義了3D水凝 膠網(wǎng)絡中細胞增殖、活力、運動和簇形成的規(guī)則，并校準了模型參數(shù)，如加倍時間、運動速度和11天 內死亡概率。我們的模型可以定量捕捉3D支架中細胞在體外打印后的行為，并能夠預測和闡明不同生 物打印條件下的細胞行為。例如，它復制了細胞運動和細胞向毛孔爬行的過程，然后在7天后由于營  養(yǎng)和氧氣分布不均勻而形成集群。此外，計算機數(shù)據(jù)闡明了細胞增殖依賴于細胞的初始數(shù)量和打印的 水凝膠網(wǎng)絡的容量，并可以根據(jù)生物墨水中細胞的初始數(shù)量預測打印后的細胞增殖。這種硅模型也可 以用含有明膠和海藻酸鹽的各種網(wǎng)絡配方來表示細胞活性。提出的數(shù)學框架可以幫助研究人員產(chǎn)生更 適合細胞生長的微環(huán)境，而無需重復實驗。因此，我們的數(shù)學框架可以被認為是涉及生物打印相關研 究進步的一個足智多慮的步驟。

材料與方法
材料。從加拿大Sigma-Aldrich公司獲得了褐藻酸鈉鹽、二甲亞砜 (DMSO)、氯化鈉、氯化鈣(CaCl2) 和牛皮明膠(B型)。對于細胞培養(yǎng)研究，MDA-MB-231購自ATCC, DMEM (Dulbecco ‘s Modified Eagle Medium)、FBS(胎牛血清)、青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶/EDTA溶液0.25% (w /v)和磷酸緩沖鹽水(PBS) 片購自Wisent Bioproducts 。 (3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基- 2h -溴化四氮唑)MTT粉末、Triton X-100、牛血清白蛋白和多聚甲醛購自加拿大Sigma-Aldrich公司。此外，活/死細胞活力測定 試劑盒(CBA415)， Hoechst 33342nucleus Dye 由Sigma-Aldrich(加拿大)提供。此外，抗ki67抗體(ab15580)和Alexa Fluor 546 山羊抗兔IgG (H+L)分別購自Abcam和Invitrogen(加拿大)。

細胞培養(yǎng)。MDA-MB-231細胞在T-75瓶中加入10%胎牛血清和1% 100 Uml-1青霉素/鏈霉素的 DMEM中培養(yǎng)。細胞在5% CO2和37℃條件下孵育，每隔一天更換一次培養(yǎng)基。當細胞達到 80%的合流度時，用 DPBS沖洗細胞兩次，然后用胰蛋白酶/EDTA (0.25%-1X)懸浮。

生物打印。為了制備生物墨水，根據(jù)歐陽等人38提供的方案，首先用去離子水制備0.5% NaCl溶液。然后加入明膠和褐藻酸鈉鹽粉，劇烈攪拌 1 h。將配制好的溶液在70℃(30 min, 3次)加熱滅菌， 4℃保存后使用。在生物打印之前，使用混合注射器將 MDA-MB-231懸浮液與制備好的明膠/海藻酸鹽溶 液輕輕均勻混合，制成最終濃度為4% (w/v) 明膠，4% (w/v)海藻酸鹽和2-2.5×1 06 MDA-MB-231 細胞 mL-1的生物墨水。

使用CELLINK INCREDIBLE+ 擠壓生物打印機進行生物打印。將制備好的生物墨水用針擠壓制成三 維細胞-水凝膠層狀網(wǎng)格結構。具體來說，本實驗使用的打印噴嘴為標準錐形噴嘴 (22G)，針的移動速 度調節(jié)為5mm-1。印刷是在室溫下施加適當?shù)膲毫ν瓿傻�。采�?nbsp;Solidwork軟件進行結構設計，在sli3r軟件中切割成10層，尺寸為10 × 10 × 3mm3 ，采用直線填充模式。在打印過程中，我們努力  將壓力保持在最低水平，以使對細胞活力的損害最小。隨后，將攜帶細胞的構建體浸泡在 3% （w/v） 無菌氯化鈣溶液中（20分鐘），使海藻酸鈉與鈣離子交聯(lián)21。然后，PBS洗滌三次后，每個結構在含有 10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)于12孔板中，在5% CO2和37℃下孵育一段預定時 間。每隔一天更換一次培養(yǎng)基。

MTT試驗。采用MTT法檢測三維網(wǎng)絡內細胞增殖。預定孵育天數(shù)后，去除含有 3D結構的12孔板中每孔中的培養(yǎng)基，在每孔中加入900µL新鮮培養(yǎng)基和100µL MTT溶液（0.5 mgmL – 1 in PBS ），在37℃CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h�？刂平M是一個沒有任何細胞的3D結構。然后，抽吸培養(yǎng)基后，在每孔中加入 1mlDMSO，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中溶解形成的甲醛晶體30min。最后，利用Absorbance Microplate Reader 在540 nm處記錄溶解后的甲醛晶體的強度。

活死檢測。根據(jù)制造商的說明，使用活/死染色活力試劑盒在特定時間點對生物 3D打印的細胞負載構建體進行染色，以確定細胞活力。簡單地說，每個構建體在 PBS中洗滌三次。然后，將1µM Calcein-  AM和2µM碘化丙啶加入染色細胞，并在黑暗中孵育。使用激光掃描共聚焦顯微鏡 (蔡司LSM 700)對三維 結構內的活細胞和死細胞進行多點成像。然后使用 ImageJ軟件對圖像進行分析。細胞活力通過將綠色 （活）細胞的數(shù)量除以每張圖像中的細胞總數(shù)來計算。

細胞增殖。Ki-67細胞增殖試驗是一種評價體外細胞增殖的定量技術。使用這種方法，Ki-67蛋白被用 作細胞增殖的標記物，因為它在活躍的細胞周期(G1, S, G2和M)表達，而不是在固定期(G0)表達。為了完成這篇文章，首先，在預定的時間步長將每個孔的培養(yǎng)基完全去除，并用PBS洗滌每個支架兩次。然后，將支架在4%多聚甲醛的PBS中室溫孵育1小時，使細胞固定。固定結構在含有0.1-0.25%Triton X-100的PBS中滲透15分鐘，用PBS洗滌2次。之后，用3% BSA/0.1% Triton X-100在PBS中阻斷 細胞1小時，然后在PBS/1% BSA中加入濃度為5µgmL-1的Anti-Ki67抗體，在4℃孵育過夜。然后，在加 入山羊抗兔IgG (H+L)二抗之前，用PBS/1% BSA清洗3次，5分鐘，孵育2小時。然后，在加入Hoechst  33,342(孵育1小時)之前，用PBS/BSA重新清洗2次，5分鐘。最后，使用激光掃描共聚焦顯微鏡對細胞 進行成像。

計算方法
細胞自動機模型描述。該模型將時間模擬為離散的、均勻的時間步長;每個時間步長為1 h，每次模 擬11天。該模型模擬了采用生物3D打印方法制備的多孔細胞負載支架的子域，該子域由190 × 190×30晶格點的方形晶格組成，對稱地由4個寬度為50 × 50 ×30晶格點的孔隙組成。水凝膠內的每個 晶格點可以被細胞占用或保持空缺，而孔隙中的網(wǎng)格點應該保持未被占用，因為相應的體外實驗中的 細胞不會移動到孔隙中(Supplementary Material，圖S2)。通過在水凝膠晶格上的隨機位置放置指定 初始數(shù)量的細胞來實例化模擬。在每個時間步，細胞的行為都遵循一組描述細胞過程的隨機規(guī)則，如 增殖、運動和死亡。生物打印中每個時間步內的主要算法和進程安排如圖9所示。計算框架建立在先  前的理論細胞群工作之上40,41。使用概述、設計概念和細節(jié)(ODD)協(xié)議制定的詳細模型描述，在補充材 料(補充材料，硅片研究)中提供。

細胞增殖過程。這個過程是模擬每個細胞單獨考慮細胞之間的變化。單個細胞的特征是一個特定的， 隨機的倍增時間，這歸因于每個細胞完成一個細胞周期分裂所需的時間。根據(jù)我們的實驗數(shù)據(jù)，每個細胞的倍增時間從正態(tài)分布中選取，其值為µ=96 h，標準差為 σ=6 h。模擬的細胞增殖周期過程包括增殖期和非增殖期(G0)之間的過渡。分裂后，親本細胞保持在當前位置，子細胞可以放置在親本細胞 附近的一個未占用的晶格點上。如果每個相鄰的位點都已被占用，親本細胞進入g0期，即靜止或靜止 期，此時細胞變得不活躍42 。一階、二階和三階摩爾鄰域用于放置子細胞。支架具有指定的最大承載  能力C來容納細胞，當達到該容量的細胞總數(shù)時，增殖以指定的概率(P0)終止。承載能力取決于體外  系統(tǒng)的空間和營養(yǎng)限制。C和P0的值根據(jù)體外觀察進行校準。由于支架內營養(yǎng)物質和氧氣分布不均，一些細胞在達到支架承載能力后仍能增殖，而另一些細胞則進入G0期。這意味著細胞可以在有足夠的 營養(yǎng)和自由鄰近晶格點的地方繼續(xù)增殖。表S1包含了所有芯片參數(shù)的值。

運動的過程。在運動過程中，細胞每移動一個特定的時間，稱為 mc，但由于所有細胞的運動可能不同 步，因此引入一個隨機數(shù)添加到mc中。mc參數(shù)的值也使用體外數(shù)據(jù)校準。在這個過程中，單個細胞可 以以隨機概率的隨機方式移動，或者以偏倚概率的偏倚隨機方式移動，如果在它們的鄰居中有一個自由的晶格點，它們就會改變它們的位置34。細胞可以以相同的概率向鄰近的六個方向 (右、左、上、下、前、后)中的一個方向移動，這被稱為隨機運動，或者以加權概率的偏隨機方式移動，其中細胞被  其他細胞和附近的毛孔吸引，這是由體外實驗的經(jīng)驗觀察所激發(fā)的。在偏隨機運動中，我們計算每個 方向(direction-p)的運動概率，這取決于一個細胞在其吸引范圍內該方向的鄰近細胞的數(shù)量，定義  為(Lc)。此外，每個方向的概率可以根據(jù)個體與特定吸引力范圍內的孔隙之間的歐幾里得距離 (Lp)而 增加。在隨機移動情況下，Pup = Pdown = Pleft = right = Pforward = Pbackward = 1/6 ，其中6  為方向數(shù)，Pup、Pdown、Pleft – right 、Pforward、Pbackward分別為細胞向上、向下、向左、向右 移動的概率。在隨機偏置情況下，Pup = P1, Pdown = P2, right = P3, Pleft = P4, Pforward =P5, Pbackward = P6 ，其中  6 i=1Pi =1。概率Pi是通過掃描和求和相鄰的細胞和孔晶格點來計算 的。在補充材料中描述了更多細節(jié)。最后，每個單元格以更大的趨勢向計算出更高概率的方向移動。

圖9 。體外和硅生物打印的主要步驟。

死亡。在模擬中，我們假設3D生物打印支架的多孔結構允許所有細胞獲得營養(yǎng)和氧氣，從而防止由于 缺乏這些重要材料而導致的死亡。然而，如果細胞在固定相中停留的時間超過特定時間(定義為Cd，在一定范圍內校準，概率為Pd)，細胞就會失去活力。表S1包含了所有芯片參數(shù)的值。

統(tǒng)計分析。使用Image J軟件對圖像進行分析。圖表和報告數(shù)據(jù)中的所有誤差條均表示至少三次重復的±SD (n≥3)。結果以mean±SD格式報道。共聚焦顯微鏡圖像的統(tǒng)計數(shù)據(jù)是通過平均每個結構至少 五個不同點的細胞數(shù)量獲得的。