在體鈣成像實(shí)驗(yàn)手術(shù)流程

簡(jiǎn)介
鈣成像技術(shù)（calcium imaging）是指利用鈣離子指示劑監(jiān)測(cè)組織內(nèi)鈣離子濃度的方法。在神經(jīng)系統(tǒng)研究方面，鈣成像技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)神經(jīng)元的活動(dòng)情況。有了鈣成像技術(shù)，原本悄無聲息的神經(jīng)活動(dòng)就變成了一幅斑斕閃爍的壯觀影像，科學(xué)家終于可以親眼看著神經(jīng)信號(hào)在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中往來穿梭。鈣成像技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)、生理與藥理研究、疾病模型研究和新藥篩選與開發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，能夠幫助科學(xué)家深入了解細(xì)胞內(nèi)的生理和病理過程。
 
原理
在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣信號(hào)與神經(jīng)細(xì)胞的興奮性、細(xì)胞通訊、遞質(zhì)釋放、突觸可塑性以及基因轉(zhuǎn)錄等諸多生理、病理過程相關(guān)。
當(dāng)神經(jīng)元膜電位發(fā)生去極化，產(chǎn)生的動(dòng)作電位傳導(dǎo)到神經(jīng)元軸突末梢時(shí)，細(xì)胞膜上的電壓門控鈣離子通道打開，大量鈣離子內(nèi)流，包含神經(jīng)遞質(zhì)的囊泡由突觸前膜釋放至后膜，下游神經(jīng)元就得以接受到上游的信號(hào)。鈣離子濃度可以表征突觸傳遞和神經(jīng)元活動(dòng)。神經(jīng)元鈣成像技術(shù)的原理就是借助鈣離子濃度與神經(jīng)元活動(dòng)之間的嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系，利用特殊的熒光染料或者蛋白質(zhì)熒光探針（鈣離子指示劑，calcium indicator），將神經(jīng)元中的鈣離子濃度通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來，從而達(dá)到監(jiān)測(cè)神經(jīng)元活動(dòng)的目的。
 
鈣成像技術(shù)應(yīng)用
1. 記錄培養(yǎng)的神經(jīng)元的活動(dòng)；
2. 記錄腦片上神經(jīng)元的活動(dòng)；
3. 活體記錄神經(jīng)元的活動(dòng)。由于離體實(shí)驗(yàn)本身的限制，現(xiàn)在越來越多的神經(jīng)科學(xué)家傾向于做活體鈣成像實(shí)驗(yàn)，希望能得到更準(zhǔn)確且更能反應(yīng)生理狀況的數(shù)據(jù)。得益于在體熒光顯微鏡的發(fā)展，現(xiàn)在，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于活體狀態(tài)下進(jìn)行鈣成像記錄的技術(shù)取得了飛速進(jìn)展。
4. 活體記錄神經(jīng)元樹突和樹突棘（spine）的活動(dòng)。由于對(duì)實(shí)驗(yàn)精度的要求，有些科學(xué)家不僅僅想記錄單個(gè)神經(jīng)元的反應(yīng)，他們還想更精確地知道神經(jīng)元上哪些樹突和樹突棘參與了某個(gè)行為，也就是說他們需要在活體條件下，對(duì)單根樹突以及樹突上spine進(jìn)行鈣成像記錄實(shí)驗(yàn)。由于雙光子熒光顯微鏡和GCaMP6基因編碼鈣離子指示劑的發(fā)展，現(xiàn)在，對(duì)樹突和樹突棘用鈣成像實(shí)驗(yàn)進(jìn)行記錄也成為了可能。
 
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

• 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

（1）GCaMP或WT小鼠
（2）大鼠
 

• 設(shè)備

（1）腦立體定位儀
（2）Inscopix在體自由活動(dòng)神經(jīng)元成像系統(tǒng)
（3）異氟烷麻醉系統(tǒng)
（4）體溫維持儀和恒溫墊
（5）手術(shù)工具，包括眼科剪、精細(xì)鑷、胰島素注射器
（6）顱鉆、0.5mm（或0.6mm、0.8mm、1.0mm）鉆頭
 

• 材料和試劑

（1）Inscopix Lens
（2）鏡頭濕巾
（3）棉簽
（4）Metabond骨膠
（5）Kwik-Sil生物硅膠
（6）紅霉素眼膏
（7）生理鹽水
（8）酒精
（9）碘伏
（10）冰
（11）鎮(zhèn)痛藥
 
 
實(shí)驗(yàn)步驟

1. 優(yōu)化病毒
首先通過組織學(xué)檢查評(píng)估特定病毒 GCaMP 指示劑（此過程可能需要多次稀釋）的優(yōu)化效果。
2. 注射病毒
注射病毒到感興趣的腦區(qū)在特定的細(xì)胞上表達(dá)GCaMP。
 
3. 埋置透鏡 :
埋植到表達(dá)了 GCaMP6 的細(xì)胞區(qū)域，用來連接微型顯微鏡。
1）將動(dòng)物固定到立體定位儀上，準(zhǔn)備顱骨進(jìn)行手術(shù)（清除組織/血液并平整顱骨）。
 
（1）動(dòng)物預(yù)麻醉后，通過耳桿和上齒固定辦固定于立體定位儀上
（2）減去頭部的毛
（3）將紅霉素眼膏涂抹到小鼠眼睛上
（4）使用碘伏和75%酒精進(jìn)行頭部皮膚的消毒
（5）沿矢狀縫作切口，剝離筋膜及肌肉，推開骨膜，用干棉球擦拭，暴露骨縫，止血。
（6）使用手術(shù)刀或顱鉆對(duì)顱骨進(jìn)行粗糙處理。
（7）通過前囟和后囟，以及前囟旁開位置（如圖中±2.0mm）進(jìn)行顱骨調(diào)平。前囟和后囟的DV＜50um。前囟旁開位置的DV＜50um。
 
2）在立體定位儀上準(zhǔn)備定位針并調(diào)整頭骨
（1）準(zhǔn)備ProView植入套件，30G鈍針，V形夾
（2）組裝ProView植入套件，并將30G鈍針夾持到底座支架上
（3）將ProView植入套件固定到立體定位儀上
（4）將30G鈍針定位到前囟點(diǎn)
（5）定位成像位置
 
3）GRIN Lens植入
（1）使用顱鉆在成像位置進(jìn)行開顱
（2）通過ProView植入套件將Lens植入到目標(biāo)區(qū)域位置。
備注：植入Lens的方法取決于Lens的規(guī)格和大腦區(qū)域。

4. 連接并成像
對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行成像并記錄數(shù)周甚至幾個(gè)月的數(shù)據(jù)。當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞激活后，胞內(nèi)鈣（Ca²⁺）水平增加，GCaMP 與鈣離子結(jié)合并產(chǎn)生瞬時(shí)熒光信號(hào)。
 
5. 處理數(shù)據(jù)
 
將鈣離子信號(hào)通過數(shù)據(jù)采集主機(jī)（DAQ）傳輸?shù)诫娔X上。使用 Inscopix Data Processing 數(shù)據(jù)處理軟件處理鈣成像視頻，提取細(xì)胞、波形和事件。
 
附件：

不同腦區(qū)適用Lens規(guī)格參考表