化學(xué)引誘受體及其同源配體是破壞腫瘤進(jìn)展級聯(lián)反應(yīng)的有前途的藥物靶點(diǎn)。大多數(shù)化學(xué)引誘受體是傳統(tǒng)的七次跨膜（7TM）G偶聯(lián)蛋白受體（GPCRs）^1,2。ACKRs（非典型趨化因子受體）與傳統(tǒng)的GPCR不同，它不激活引導(dǎo)細(xì)胞遷移所需的依賴于 G 蛋白的信號傳導(dǎo)^3,4。相反，它們通過充當(dāng)清道夫受體、促進(jìn)趨化因子內(nèi)吞作用或產(chǎn)生趨化因子梯度來調(diào)節(jié)趨化因子的可用性。

C-C基序趨化因子受體樣2(CCRL2)是一種與 ACKR 家族相關(guān)的非信號轉(zhuǎn)導(dǎo)7TM 受體⁵。然而，CCRL2與ACKRs不同，因為它缺乏配體清除功能，也缺乏與經(jīng)典趨化因子結(jié)合確認(rèn)的能力。CCRL2 是一種非信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，它能與趨化配體結(jié)合，使白細(xì)胞被招募到炎癥部位。然而，人們對直接與 CCRL2 結(jié)合的配體類型和功能影響還缺乏了解。

最近在表面等離子體共振領(lǐng)域技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)了在自然表達(dá)條件下配體-受體相互作用的表征。表面等離子體共振（SPR）顯微鏡結(jié)合了SPR和明場顯微鏡（圖1A）來檢測未標(biāo)記分子與細(xì)胞表面目標(biāo)的結(jié)合。^6-8
 

圖 1 (A)SPRM 儀器的示意圖，描繪了 SPR 和明場輸入、細(xì)胞室和樣品流。⁹（B） Chemerin 與跨膜 CCRL2 受體結(jié)合。

SPRM 測量整個細(xì)胞表面分子相互作用的動力學(xué)，對于確定配體與細(xì)胞表面表達(dá)受體的結(jié)合速率（ka）、解離速率（kd）和結(jié)合親和力（KD）至關(guān)重要。利用BI的ImageSPR™ 分析軟件，SPRM 傳感器表面被均勻地劃分為數(shù)百個興趣區(qū)域（ROI）。

在本研究中，使用BI SPRm200儀器證實，在親代 HEK 293T 細(xì)胞和變異型 HEK-huCCRL2 細(xì)胞上⁹，一種非趨化因子趨化蛋白--Chemerin與CCRL2 結(jié)合（圖 1B）。當(dāng)Chemerin暴露于HEK-huCCRL2 細(xì)胞時，在細(xì)胞上觀察到大量的ROI（圖 2A），但當(dāng)Chemerin暴露于親代HEK細(xì)胞時，只有少量的ROI出現(xiàn)（圖 2B），這表明Chemerin能特異性地結(jié)合表達(dá)CCRL2 的細(xì)胞。采用 1:1 結(jié)合模型評估Chemerin與表達(dá) HEK-huCCRL2 細(xì)胞結(jié)合的動力學(xué)數(shù)據(jù)，顯示計算的結(jié)合速率、解離速率和結(jié)合親和力（圖 2C、D 和 E）直方圖趨于穩(wěn)健高斯分布，其中檢測到Chemerin在親代HEK細(xì)胞中的結(jié)合率極低，KD 值無法計算。本研究報告了實驗中Chemerin與HEK-huCCRL2細(xì)胞結(jié)合的平均值，包括結(jié)合速率（ka = 3.11E+05 M-1 s -1 ）、解離速率（kd = 1.16E-03 s -1 ）和結(jié)合親和力（KD = 5.49 nM）。重要的是，通過 SPRM 測定的Chemerin與 huCCRL2 結(jié)合的平均 KD 與之前報道的通過放射性標(biāo)記的Chemerin與過表達(dá) huCCRL210 的細(xì)胞結(jié)合而測定的結(jié)合親和力（2.35 nM）相當(dāng)¹⁰。
 

表 1 Chemerin與 HEK-huCCRL2 的結(jié)合概況

通過 SPRM，可以對一種以前未報道過的 C-C 趨化因子進(jìn)行直接結(jié)合和動力學(xué)分析。研究人員測定了 Chemerin 與 HEK 293T 親本細(xì)胞以及 HEKhuCCRL2 變體細(xì)胞上的 CCRL2 的結(jié)合動力學(xué)。

CCRL2 不激活細(xì)胞內(nèi)的 G 蛋白，而是將配體集中在質(zhì)膜上¹¹ 。該受體的下游信號傳導(dǎo)機(jī)制尚不清楚，因此鑒定能中和 CCRL2 與配體結(jié)合的工具是研究其功能的主要途徑。為此，我們使用 SPRM 作為一種確證抗體結(jié)合的方法，研究兩種抗 huCCRL2 單克隆抗體（K097F7 和 152254）與 HEK-huCCRL2 細(xì)胞和親代 HEK 293T 細(xì)胞的結(jié)合動力學(xué)。在 HEK-huCCRL2 細(xì)胞上檢測到了大量的 ROI（圖 3A 和 3B），但在親代 HEK 細(xì)胞上沒有檢測到。
 

表 2 與 HEK-huCCRL2 結(jié)合的中和抗體概況

K097F7 和 152254 與 HEK-huCCRL2 細(xì)胞的結(jié)合親和力（KD）分別為 2.48 nM 和 4.75 nM（表 2），重要的是，K097F7 和 152254 與親代 HEK 細(xì)胞的最小結(jié)合導(dǎo)致 KD 值無法計算。此外，觀察到同型對照抗體與 HEK-huCCRL2 細(xì)胞的結(jié)合極少（圖 3C），這表明 K097F7 和 152254 與 CCRL2 是特異性結(jié)合。
 

SPRm200系統(tǒng)將光學(xué)顯微鏡與分子互作技術(shù)相結(jié)合，專為觀察和測量細(xì)胞膜表面蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合親和力及動力學(xué)常數(shù)設(shè)計，為分子相互作用的研究開辟了新的方法。
(1)SPRm200系統(tǒng)無需對觀察目標(biāo)進(jìn)行標(biāo)記，可以實時定量的進(jìn)行檢測；
(2)可同時可視化觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和局部結(jié)合活性；
(3)無需提取細(xì)胞膜蛋白，即可在正�；罴�(xì)胞狀態(tài)下觀察和測量藥物和膜蛋白的實時相互作用；
(4)探測器測量每個像素點(diǎn)的SPR響應(yīng)，并將其映射到SPR圖像中，在每個像素處，記錄一個傳感圖，從而提供更多的局部信息。

SPRM技術(shù)使在自然條件下研究細(xì)胞表面膜蛋白與其他目標(biāo)分子結(jié)合和相互作用成為可能。SPRm200細(xì)胞原位分子互作動態(tài)分析系統(tǒng)憑借其卓越的靈敏度和穩(wěn)定性，助力科學(xué)研究新發(fā)現(xiàn)，推動藥物開發(fā)新高度。

參考文獻(xiàn)
1) Zlotnik A, Yoshie O. Chemokines: a new classification system and their role in immunity. Immunity.2000;12(2):121–7. Pmid:10714678
2) Zlotnik A, Yoshie O. The chemokine superfamily revisited. Immunity. 2012;36(5):705–16. Pmid:22633458
3) Nibbs RJB, Graham GJ. Immune regulation by atypical chemokine receptors. Nat Rev Immunol.2013;13(11):815–29. Pmid:24319779
4) Bonecchi R, Graham GJ. Atypical chemokine receptors and their roles in the resolution of the inflammatory response. Front Immunol. 2016;7:224. Pmid:27375622
5) Schioppa T, Sozio F, Barbazza I, Scutera S, Bosisio D, Sozzani S, et al. Molecular basis for CCRL2 regulation of leukocyte migration. Front Cell Dev Biol. 2020;8:615031. Pmid:33363177
6) Wang W, Yang Y, Wang S, Nagaraj VJ, Liu Q, Wu J, et al. Label-free measuring and mapping of binding kinetics of membrane proteins in single living cells. Nat Chem. 2012;4(10):846–53. Pmid:23000999
7) Wang W, Yin L, Gonzalez-Malerva L, Wang S, Yu X, Eaton S, et al. In situ drug-receptor binding kinetics in single cells: a quantitative label-free study of anti-tumor drug resistance. Sci Rep. 2014;4:6609. Pmid:25312029
8) Zhang F, Wang S, Yin L, Yang Y, Guan Y, Wang W, et al. Quantification of epidermal growth factor receptor expression level and binding kinetics on cell surfaces by surface plasmon resonance imaging. Anal Chem. 2015;87(19):9960–5. Pmid:2636833
9) Su, Z., Brooks, J., Pelker, J., Andreyeva, T., Sobon, H., Gifford, R., Powers, M., Wang, J., Dower, C., Hegen, M. and Messing, D., 2023. Studies with neutralizing antibodies suggest CXCL8-mediated neutrophil activation is independent of CC motif chemokine receptor-like 2 (CCRL2) ligand binding function. PloS one, 18(1), p.e0280590.
10) De Henau O, Degroot GN, Imbault V, Robert V, De Poorter C, McHeik S, et al. Signaling properties of chemerin receptors CMKLR1, GPR1 and CCRL2. PLOS One. 2016;11(10):e0164179. pmid:27716822.
11) Del Prete A, Bonecchi R, Vecchi A, Mantovani A, Sozzani S. CCRL2, a fringe member of the atypical chemoattractant receptor family. Eur J Immunol. 2013;43(6):1418–22. pmid:23580473