空間多組學(xué)技術(shù)，是近年來逐漸興起的分子組學(xué)研究技術(shù)，與傳統(tǒng)的組學(xué)技術(shù)相比，在檢測基因、蛋白質(zhì)、代謝物表達水平的同時，獲得其空間位置信息。此外，將這些數(shù)據(jù)結(jié)果與病理圖像信息相結(jié)合，便可探究疾病發(fā)展過程中重要區(qū)域內(nèi)的分子表達、細胞分布及信號通路的變化特征。2022年，Nature Methods將空間多組學(xué)技術(shù)評為年度技術(shù)，足見其在生物學(xué)研究中發(fā)揮的重要作用。因此，為了讓大家能掌握空間多組學(xué)的研究思路，小編帶來了一篇Matthias Mann教授團隊的文章，以空間蛋白質(zhì)組+空間轉(zhuǎn)錄組為例，看空間多組學(xué)技術(shù)如何應(yīng)用于腫瘤新療法的開發(fā)工作。

文章題目：Spatial proteo-transcriptomic profiling reveals the molecular landscape of borderline ovarian tumors and their invasive progression
中文題目：空間蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄圖譜揭示交界性卵巢癌及其侵襲性進展的分子特征
發(fā)表時間：2023.11.13
期刊名稱：medRxiv
影響因子：無
實驗平臺：LCM+timsTOF SCP+GeoMx DSP
DOI：10.1101/2023.11.13.23298409

研究背景 

漿液性交界性腫瘤(SBT)是卵巢的上皮性腫瘤性病變，通常預(yù)后良好。然而，在10-15%的病例中，SBT會復(fù)發(fā)為低級別漿液性癌(LGSC)，這種腫瘤具有很深的侵襲性，對當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)的化療方案應(yīng)答很差。雖然基因改變表明有共同的起源，但從SBT到LGSC的轉(zhuǎn)變?nèi)匀浑y以理解。因此，本研究借助空間蛋白質(zhì)組和空間轉(zhuǎn)錄組的力量，探究SBT向LGSC的侵襲性轉(zhuǎn)化過程中蛋白質(zhì)/轉(zhuǎn)錄本表達及信號通路的變化信息，尋找更有效的治療方法。

技術(shù)路線  

為了方便各位老師快速掌握研究思路和結(jié)果，小編繪制了文章的研究框架圖，供各位觀賞。
 

組織類型：患者組織切片，包括SBT、微乳頭狀SBT（SBT-MP）、原發(fā)LGSC（LGSC-PT）和轉(zhuǎn)移LGSC（LGSC-Met）四個疾病階段的樣品。

空間蛋白質(zhì)組（DVP）檢測方法：使用 nucleAIzer AI算法在切片上分割細胞群，并結(jié)合激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）和高靈敏度的4D質(zhì)譜儀timsTOF進行切割捕獲和蛋白質(zhì)組分析。

空間轉(zhuǎn)錄組（DSP）檢測方法：使用GeoMx DSP技術(shù)分析切片中感興趣區(qū)域（ROI）的轉(zhuǎn)錄組信息。

研究結(jié)果 

1.  DVP 揭示交界性腫瘤向LGSC-Met的進展

對上皮組織空間蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進行PCA分析發(fā)現(xiàn)四種階段的腫瘤組織能夠有序的聚類，并且微乳頭狀生長是非侵襲性SBT和侵襲性低級別腫瘤的中間階段。線性回歸分析，確定了在侵襲性表型中195個蛋白質(zhì)的上調(diào)和下調(diào)，代表了從SBT到LGSC及相應(yīng)癌轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)變過程。具有微乳頭狀特征的SBT作為LGSC復(fù)發(fā)的風(fēng)險較高。然而，關(guān)于SBT-MP是否是LGSC的前體存在爭議。DVP數(shù)據(jù)表明，SBT-MP和SBT的蛋白質(zhì)表達在代謝方面發(fā)生顯著變化，AHDC1 和 ERF以及與腫瘤干性相關(guān)的蛋白質(zhì)在SBT-MP中上調(diào)，而腫瘤抑制因子則下調(diào)。整體而言，SBT-MP的蛋白質(zhì)表達更類似于SBT，但在多個方面反映了惡性轉(zhuǎn)化的特征。MAPK信號通路在LGSC和SBT中發(fā)生了改變，ERK1/2和Met信號在LGSC中富集。此外，TGF-β信號通路下游的多個蛋白質(zhì)在SBT-MP或LGSC中逐漸上調(diào)。大多數(shù)SBT和LGSC表達激素受體，在抗激素治療上具有暫時的響應(yīng)性。從SBT到SBT-MP時孕激素結(jié)合蛋白PGRMC2逐漸增加，表明孕激素在早期向LGSC過渡過程中發(fā)揮作用。此外，一些蛋白質(zhì)的表達隨著階段發(fā)展發(fā)生變化，如PAX8、CAPS等，在SBT中表達，但在LGSC中逐漸喪失，NOVA2在LGSC中表達，但在SBT和SBT-MP中不表達。
 

Fig.1 腫瘤上皮區(qū)的空間蛋白質(zhì)組分析鑒定SBT向LGSC轉(zhuǎn)變的新途徑

2. 腫瘤微環(huán)境的空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析

在基質(zhì)細胞中，從SBT到LGSC過程中，發(fā)現(xiàn)178種蛋白質(zhì)顯著變化。PCA分析表明SBT和SBT-MP的蛋白質(zhì)表達譜與LGSC及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)移存在明顯區(qū)別，與上皮區(qū)域不同，SBT和SBT-MP的基質(zhì)非常相似，沒有向LGSC過渡的中間進展。在SBT向LGSC轉(zhuǎn)變過程中，與腫瘤增殖和EMT相關(guān)的蛋白表達發(fā)生變化。這些表達變化伴隨著ECM重塑蛋白的顯著變化，表明了密集的腫瘤微環(huán)境。LGSC-PT中細胞動態(tài)相關(guān)的生物學(xué)過程上調(diào)，與ephrin信號通路相關(guān)。基質(zhì)從非侵襲性到侵襲性腫瘤階段的過渡伴隨著葡萄糖代謝的增加，以及NNMT等蛋白的上調(diào)，這些蛋白在侵襲性LGSC中高表達。
 

Fig.2 腫瘤基質(zhì)區(qū)的空間蛋白質(zhì)組分析揭示SBT向LGSC轉(zhuǎn)變的雙向性

3. SBT向侵襲性LGSC進展過程中空間轉(zhuǎn)錄組的特征變化

蛋白質(zhì)表達最能反映細胞的功能表型，然而，將蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄組變化聯(lián)系起來能更好地理解LGSC的生物學(xué)特征，提供腫瘤細胞和周圍基質(zhì)細胞的通訊信息，識別只用一種組學(xué)分析手段可能錯過的治療靶點。使用GeoMx DSP技術(shù)，對ROI的轉(zhuǎn)錄組進行檢測。在上皮中，發(fā)現(xiàn)1,386個轉(zhuǎn)錄本在SBT和LGSC-PT之間有差異表達。在SBT中，AGR2和MUC5B等基因上調(diào)，而在LGSC中則上調(diào)了CA-125結(jié)合伙伴MSLN和絲氨酸蛋白酶KLK6等基因。有趣的是，在LGSC-PT中，幾個在神經(jīng)系統(tǒng)中高表達的基因轉(zhuǎn)錄本，如SPOCK2和SNCG被上調(diào)。在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)在SBT到SBT-MP的早期轉(zhuǎn)變過程中，SNCG蛋白上調(diào)。GSEA分析發(fā)現(xiàn)粘蛋白編碼基因表達水平、組織遷移、信號素通路和對EGF的應(yīng)答發(fā)生變化。RTK受體c-Met及其下游效應(yīng)子在LGSC和LGSC-Met中顯著增加，與空間蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。PCA分析表明上皮中SBT和SBT-MP的差異，基質(zhì)基因表達明顯區(qū)分了SBT/SBT-MP和LGSC-PT/LGSC-Met。已知的基質(zhì)轉(zhuǎn)錄本，如S100A10、C3和NNMT，與空間蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相一致。在CAFs中，上調(diào)的通路包括的基因與血管生成和缺氧有關(guān)。
 

Fig.3 SBT和LGSC的空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果

4. 整合空間轉(zhuǎn)錄組和空間蛋白質(zhì)組

整合空間蛋白質(zhì)組、空間轉(zhuǎn)錄組和HE染色結(jié)果，可能在理解腫瘤器官時相互補充。特別是，蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄本表達的整合能夠揭示轉(zhuǎn)錄和翻譯之間復(fù)雜的相互作用。在上皮和基質(zhì)中，DVP和DSP之間有部分重疊的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄本，但差異表達的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄本重疊很少。這些結(jié)果表明兩種技術(shù)可檢測到的基因產(chǎn)物和生物調(diào)控方面的差異。因此，研究者將兩種技術(shù)均定量檢測到的基因用于下游分析，分別從上皮和基質(zhì)中選擇了兩種技術(shù)檢測到的最相關(guān)的蛋白質(zhì)/轉(zhuǎn)錄本，并從下調(diào)表達結(jié)果中篩選出70個存在于腫瘤抑制因子數(shù)據(jù)庫的靶點基因，結(jié)合文獻綜述注釋其生物學(xué)相關(guān)性。這其中多個蛋白質(zhì)都是臨床批準(zhǔn)或臨床前抑制劑的靶點，如CCN2、ANXA2、ADAM15等。
 

Fig.4 整合空間蛋白質(zhì)組和空間轉(zhuǎn)錄組

5. 驗證實驗表征SBT向LGSC的轉(zhuǎn)變過程

在描繪了從SBT到LGSC-met轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組圖譜后，對幾種LGSC細胞系進行質(zhì)譜檢測，并將其與空間蛋白質(zhì)組學(xué)獲取的上皮區(qū)域數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)這些細胞系與SBT和LGSC-PT上皮中的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果呈正相關(guān)。使用 VOA4627 LGSC 細胞系進行 siRNA 篩選，揭示了ADAM15、CLIC3、NOVA2、POSTN和SNCG等基因?qū)�細胞遷移的關(guān)鍵作用。對FDA批準(zhǔn)的抑制劑進行測試顯示，c-MET、EGFR和CDK抑制劑抑制了LGSC細胞系的增殖和侵襲，而FOLR1-抗體藥物結(jié)合物僅抑制了細胞增殖。NNMT在LGSC中是最顯著上調(diào)的基質(zhì)驅(qū)動因子，在體內(nèi)模型中，NNMT抑制劑減緩了LGSC細胞的皮下腫瘤生長�？傮w而言，從空間蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果中預(yù)測關(guān)鍵通路和靶點，并使用FDA批準(zhǔn)的抑制劑進行功能驗證的思路，在研究LGSC進展時有關(guān)鍵作用。
 

Fig.5 SBT向LGSC轉(zhuǎn)變過程中重要的“組學(xué)”基因和通路的功能研究

 
主要結(jié)論 

本研究利用空間蛋白質(zhì)組和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)闡明從SBT到LGSC及癌轉(zhuǎn)移的演變過程中腫瘤和基質(zhì)分子水平的變化特征。從SBT到LGSC的過渡發(fā)生在上皮組織中，經(jīng)過具有微小乳頭特征的中間階段（SBT-MP），其中涉及MAPK信號逐漸增加。一組獨特的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄本與向侵襲性腫瘤生長的過渡相關(guān)，包括在LGSC及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)移中表達的神經(jīng)剪接因子NOVA2。通路分析揭示了腫瘤細胞的異常分子信號傳導(dǎo)，受到腫瘤微環(huán)境中血管生成和炎癥變化的支持。隨后通過敲除改變最大的基因或?qū)ψ钕嚓P(guān)的靶點進行藥物抑制，證實了它們在調(diào)控侵襲性的關(guān)鍵特征方面的功能重要性。結(jié)合細胞類型分辨的空間蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)，使我們能夠闡明從SBT到LGSC的腫瘤發(fā)生序列。這里提出的方法是系統(tǒng)闡明腫瘤發(fā)生機制和發(fā)現(xiàn)新治療策略的藍圖。

參考文獻： 

Schweizer, Lisa et al. “Spatial proteo-transcriptomic profiling reveals the molecular landscape of borderline ovarian tumors and their invasive progression.” medRxiv 2023.11.13.23298409.