測(cè)序技術(shù)在缺鐵對(duì)后代大腦發(fā)育及行為研究的應(yīng)用
缺鐵（ID）是世界上普遍的營(yíng)養(yǎng)缺乏癥。鐵被認(rèn)為是包括神經(jīng)發(fā)育在內(nèi)的許多生物過程的必需元素。在懷孕期間，發(fā)育中的大腦特別容易受到環(huán)境損害，這可能會(huì)不可逆轉(zhuǎn)地?fù)p害關(guān)鍵的發(fā)育過程。雖然成年期慢性智力障礙導(dǎo)致的許多功能障礙可以通過補(bǔ)充鐵劑來(lái)逆轉(zhuǎn)，但胎兒時(shí)期的智力障礙對(duì)大腦結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生持續(xù)影響。
在幾個(gè)大腦區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了胎兒缺鐵導(dǎo)致的改變，大量證據(jù)發(fā)現(xiàn)海馬體的脆弱性，海馬體是一個(gè)在圍產(chǎn)期具有高代謝需求和廣泛發(fā)育的區(qū)域。海馬體在學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮著重要作用，其病理改變與兒童早期智力缺陷后的認(rèn)知缺陷密切相關(guān)。
在這里，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)小鼠模型來(lái)檢驗(yàn)這樣一種假設(shè)，即妊娠期和哺乳期早期母體飲食供應(yīng)保持缺鐵性飲食，導(dǎo)致的胎兒和新生兒缺鐵與成年后代抑郁和焦慮樣行為有關(guān)。我們?cè)谀Ｐ椭腥婷枋隽巳辫F的行為后果，從產(chǎn)后早期對(duì)母親行為和小鼠超聲波發(fā)聲的評(píng)估，到成年后代的抑郁和焦慮樣行為。通過定義其在成年海馬體中的miRNA特征，揭示了早期生命缺鐵對(duì)大腦分子組成的長(zhǎng)期影響。
研究方法
本研究采用了飲食鐵限制的小鼠模型，其中母鼠在整個(gè)懷孕期間和哺乳早期接受缺鐵飲食 (IDD)，圖 1 A。在此背景下，我們決定使用48ppm的飲食作為邊際IDD，使用96ppm的飲食作為鐵充足飲食 (ISD)對(duì)照，這樣可以評(píng)估妊娠缺鐵的長(zhǎng)期后果，而不會(huì)出現(xiàn)胎兒生長(zhǎng)遲緩或母體貧血的非特異性偏差。這相當(dāng)于孕婦每日膳食攝入13.5毫克鐵（比每天 27 毫克減少50%）。
圖1
產(chǎn)婦護(hù)理行為
在PD1和PD6之間，每天上午11點(diǎn)至下午1點(diǎn)和下午3點(diǎn)至5點(diǎn)使用攝像頭記錄，每 3分鐘對(duì)行為進(jìn)行一次視頻評(píng)分，包括對(duì)幼鼠舔/梳理、筑巢、護(hù)理和非幼鼠相關(guān)參數(shù)（進(jìn)食/睡眠、自我梳理）的評(píng)估。展示個(gè)人行為所花費(fèi)的時(shí)間被描述為總行為活動(dòng)的百分比（%）。
超聲波發(fā)聲
在PD4上，從每窩中隨機(jī)選擇4只幼崽來(lái)評(píng)估超聲波發(fā)聲 (USV) 叫聲。為此，將幼鼠單獨(dú)放置在一個(gè)裝有USB超聲波麥克風(fēng)的隔音箱中3分鐘。使用諾達(dá)思的聲音行為分析系統(tǒng)(UltraVox XT)對(duì)獲得的聲譜圖進(jìn)行分析，以計(jì)算呼叫的數(shù)量和幅度。
聲音行為分析系統(tǒng)(UltraVox XT)可以通過捕獲完整的聲譜，處理和分析嚙齒動(dòng)物的超聲波聲和其它動(dòng)物的聲音。您可以在頻譜圖中直觀地選擇叫聲，并根據(jù)頻率、幅度、持續(xù)時(shí)間和時(shí)間間隔對(duì)類似的叫聲進(jìn)行分類。您也可以將聲音數(shù)據(jù)輕松導(dǎo)出到動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)和行為觀察記錄分析系統(tǒng)(The Observer XT)中，與其它行為數(shù)據(jù)結(jié)合分析。
更多測(cè)試
本研究還會(huì)進(jìn)行蔗糖偏好測(cè)試、曠場(chǎng)測(cè)試、明暗箱試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)測(cè)試、強(qiáng)迫游泳測(cè)試、尾部懸掛測(cè)試、血液分析等測(cè)定，以及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)、大腦分析（普魯士藍(lán)染色、NeuN染色）、神經(jīng)發(fā)生分析和miRNA測(cè)序。對(duì)于許多測(cè)試中動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡的追蹤可以使用動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)來(lái)輕松實(shí)現(xiàn)。
動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)是應(yīng)用于跟蹤和分析任何動(dòng)物的行為、運(yùn)動(dòng)和活動(dòng)研究中最廣泛的視頻跟蹤軟件。在研究魚類或昆蟲時(shí)，還可以結(jié)合兩個(gè)攝像機(jī)角度對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行跟蹤，并結(jié)合三維軌跡跟蹤系統(tǒng)中的三維跟蹤項(xiàng)目實(shí)現(xiàn)三維追蹤。
結(jié)果
缺鐵不會(huì)改變幼鼠出生前或出生后的生長(zhǎng)，但會(huì)降低腦鐵含量
我們首先確認(rèn)，接受 IDD（48ppm FeSO4；n=38）和 ISD（96ppm FeSO4；n=43）的母親在懷孕期間體重增加沒有差異。此外，IDD 對(duì)每窩幼仔數(shù)量（圖 1，C）、每窩活幼仔百分比（圖 1，D）或其出生體重（圖 1，E））沒有影響 ，證實(shí) IDD 不會(huì)導(dǎo)致宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩/死亡或胎兒死亡。為了防止由于出生后大量生長(zhǎng)期間鐵需求大幅增加而造成的生長(zhǎng)偏差，所有動(dòng)物在PD10時(shí)均轉(zhuǎn)為 ISD。
在 PD11 對(duì)IDD和ISD后代的腦海馬切片測(cè)定非血紅素鐵（n = 6）。普魯士藍(lán)染色顯示 IDD 幼崽海馬體中鐵含量顯著降低（圖 2（A，B））。使用神經(jīng)元標(biāo)記NeuN進(jìn)行的免疫組織化學(xué)顯示，IDD和ISD后代的神經(jīng)元密度具有可比性（圖 2，C），表明邊緣胎兒ID不會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元丟失或阻礙神經(jīng)發(fā)生。
圖2
另外，成年IDD和ISD動(dòng)物的海馬鐵含量沒有差異（圖2（D，E）），證實(shí)幼年期鐵儲(chǔ)備的補(bǔ)充足以使腦鐵含量達(dá)到成年期的控制水平。
產(chǎn)后護(hù)理行為
本研究通過產(chǎn)后前六天的觀察評(píng)估了IDD和ISD母鼠的自發(fā)孕產(chǎn)婦護(hù)理行為 (n=6)，發(fā)現(xiàn) IDD母親舔舐和梳理幼崽的相對(duì)時(shí)間有選擇性和具體的減少，但沒有其他幼崽指導(dǎo)（護(hù)理和筑巢）或非幼崽指導(dǎo)的（自我梳理、睡眠、飲食）行為表現(xiàn)（圖3（A，B））。
母性關(guān)懷行為是一種基于母親與子女互動(dòng)的社會(huì)行為形式。幼崽與母親的交流是通過幼崽超聲波發(fā)聲來(lái)進(jìn)行的。然而，我們發(fā)現(xiàn) IDD 幼崽的超聲波發(fā)聲沒有改變，IDD幼崽和ISD幼崽發(fā)出的超聲波叫聲的數(shù)量及其幅度相當(dāng)（圖 3（C-E）），這表明在這個(gè)發(fā)育階段，幼崽不太可能出現(xiàn)溝通障礙，并且IDD幼崽能夠有效地與母親互動(dòng)。
圖3
生命早期的缺鐵持續(xù)擾亂情感行為
本研究測(cè)試了具有胎兒/新生兒ID史的成年雌性和雄性動(dòng)物（P90-P120；n=20-28），并在一組高度特定的行為范式標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)試了對(duì)照組：蔗糖偏好測(cè)試、強(qiáng)迫游泳測(cè)試、懸尾測(cè)試、明暗箱、曠場(chǎng)測(cè)試。在所有測(cè)試中，一致發(fā)現(xiàn)胎兒/新生兒ID后動(dòng)物的抑郁和焦慮樣行為有所增加。這反映在強(qiáng)迫游泳和懸尾測(cè)試中的行為絕望（不動(dòng)）顯著增加（圖 4（A，B）），以及明暗箱中焦慮樣行為增加（在明處中花費(fèi)的時(shí)間減少）（圖 4，C））。在蔗糖偏好測(cè)試中，對(duì)蔗糖的偏好沒有顯著差異（圖4，D）。未發(fā)現(xiàn)成年IDD后代在開闊場(chǎng)地測(cè)試中的一般探索行為和旋轉(zhuǎn)棒的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)發(fā)生變化（圖4（E，F(xiàn)）），排除了不具體的表現(xiàn)偏差，并證實(shí)了專門評(píng)估情感行為的測(cè)試結(jié)果的相關(guān)性。
圖4
缺鐵后成人海馬祖細(xì)胞增殖保持完整
在各種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)以及人體研究中，有大量證據(jù)支持成人海馬神經(jīng)發(fā)生在抑郁癥和抗抑郁治療反應(yīng)中的作用。因此，我們開始使用5-Bromo-2 Deoxyuridine（BrdU）標(biāo)記齒狀回中新生成的細(xì)胞來(lái)評(píng)估海馬祖細(xì)胞的增殖，來(lái)測(cè)試海馬神經(jīng)發(fā)生的紊亂是否與胎兒/新生兒ID后小鼠的行為缺陷有關(guān)（圖5，A）。我們發(fā)現(xiàn)IDD和ISD動(dòng)物之間的新生細(xì)胞數(shù)量沒有差異（圖5（B，C）），并進(jìn)一步證實(shí)NeuN免疫組織化學(xué)顯示的神經(jīng)元總數(shù)在各組之間具有可比性（圖5，D）。
圖5
獨(dú)特的miRNA表達(dá)反映了早期生命缺鐵對(duì)大腦的長(zhǎng)期影響
miRNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并參與多種精神疾病的病理生理學(xué)。重要的是，鐵在 miRNA通路的活性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在此背景下，我們決定在胎兒 ID 后對(duì)成年動(dòng)物的海馬組織進(jìn)行無(wú)偏miRNA測(cè)序。
經(jīng)過多次測(cè)試的統(tǒng)計(jì)校正后，我們確定了IDD和ISD成年后代之間表達(dá)顯著差異的530個(gè) miRNA。與對(duì)照組相比，在有早年ID史的動(dòng)物海馬組織中，其中284個(gè)miRNA上調(diào)，246 個(gè)miRNA下調(diào)（圖 6，A）。
僅考慮那些 log2 倍變化≥ +1.5 或≤−1.5 的miRNA，揭示了早期生命ID對(duì)同一家族的兩個(gè)miRNA（miR 200a和miR 200b）的選擇性和特異性影響，這兩個(gè) miRNA 均位于小鼠 4 號(hào)染色體上。靶基因預(yù)測(cè)揭示了miRNA 200a和miRNA 200b的253個(gè)共享靶基因（圖 6，B）。對(duì)預(yù)測(cè)的共享目標(biāo)的生物功能（圖6，C）的進(jìn)一步生物信息學(xué)分析顯示，有大量顯著富集的基因集。
圖6
討論
在這項(xiàng)研究中，即使在懷孕和哺乳期間，鐵的供應(yīng)量略有減少，也足以使胎兒大腦發(fā)育偏向于對(duì)心理健康，特別是抑郁癥的不利后果。盡管大腦發(fā)育的主要部分發(fā)生在妊娠末期，但本研究設(shè)計(jì)在整個(gè)妊娠期限制了飲食中的鐵攝入量，以更接近于人類的情況。所提供的數(shù)據(jù)顯示，懷孕期間飲食鐵攝入量?jī)H減少50%，就會(huì)降低幼年后代大腦的鐵含量，并對(duì)成年后代的情感行為產(chǎn)生長(zhǎng)期影響，這是由抑郁和焦慮樣行為增加的表型特征定義的，但對(duì)鐵儲(chǔ)存和血清鐵指數(shù)沒有持續(xù)影響。
IDD母鼠的舔舐/理毛行為水平低于對(duì)照組，妊娠ID損害了自發(fā)的產(chǎn)婦護(hù)理行為。母親的照顧行為對(duì)后代的發(fā)育很重要，具體而言，母親的舔舐/梳理行為是新生嚙齒動(dòng)物觸覺刺激的主要來(lái)源，可調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、情緒和對(duì)壓力的認(rèn)知反應(yīng)的發(fā)展，因此會(huì)增加患情感障礙（包括抑郁癥）的風(fēng)險(xiǎn)和焦慮癥。不能排除IDD后代的行為表型至少部分是由于產(chǎn)后早期接受的護(hù)理行為減少的結(jié)果。
本研究結(jié)果揭示了成年IDD后代海馬組織中兩種 miRNA（miR 200a 和 miR 200b）的特異性和選擇性失調(diào)。考慮到大量證據(jù)支持miRNA在大腦發(fā)育中的重要作用，以及關(guān)于miRNA在控制行為和情緒中的功能的新興文獻(xiàn)，特別是在這種調(diào)節(jié)受損的精神疾病中，這一觀察結(jié)果是相關(guān)的。miR 200a和miR 200b及其靶基因可能構(gòu)成基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)形成了早期生命ID對(duì)情感行為影響的病理生理事件的分子基礎(chǔ)。
結(jié)論
總的來(lái)說(shuō)，在懷孕和哺乳期間接受缺鐵性食物的母親所孕育的幼崽腦鐵含量降低，母親有明顯較少的舔舐和梳理行為。有胎兒和新生兒缺鐵病史的成年后代表現(xiàn)出抑郁和焦慮樣行為的增加，同時(shí)海馬中的miRNA表達(dá)譜紊亂，特別是miR200a和miR200b的水平。胎兒期和新生兒期的缺鐵對(duì)小鼠的情感行為具有終身影響，并在大腦中的miRNA表達(dá)上留下了特定而持久的印記。胎兒和新生兒缺鐵需要進(jìn)一步被視為日后發(fā)展為抑郁癥和焦慮癥的風(fēng)險(xiǎn)因素。
參考文獻(xiàn)
Gundacker, Anna, et al. "Early-life iron deficiency persistently disrupts affective behaviour in mice." Annals of Medicine 55.1 (2023): 1265-1277.
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