有效地均質(zhì)化生物組織和破壞細胞的能力對于產(chǎn)生足夠質(zhì)量和數(shù)量的DNA和RNA研究所需的核酸至關(guān)重要。此外，由于其整體異質(zhì)性或?qū)嶒炇医邮盏降臓顟B(tài)，許多樣品需要均質(zhì)化或減小顆粒大小以創(chuàng)建代表性樣品。均勻性是指在整個樣品中具有一致組成狀態(tài)，而異質(zhì)性則在一個或多個特征上缺乏一致性。

實驗室或分析樣品必須經(jīng)過處理，以便進行提取、加工或消化以進行進一步測試。在生物樣品中，均質(zhì)化可以通過破壞生物組織和溶解細胞來加速處理速度，從而允許提取遺傳物質(zhì)。獲得均勻樣品的最常見方法是研磨或粉碎，這可以提高準確性并減少不確定性。在實驗室中，一些科學(xué)家使用手動或半自動的方法進行組織處理，這可能會耗費時間并且產(chǎn)生的樣品可能沒有完荃均質(zhì)化。實施自動化的均質(zhì)化和處理可以提高樣品的處理量，同時從生物材料中更快地恢復(fù)DNA/RNA。

這項研究將證明使用自動化均質(zhì)化方法在節(jié)省時間方面的效率，以及對遺傳物質(zhì)的回收和提取的改進。在之前使用Spex Geno/Grinder^®的研究中，發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)和環(huán)境產(chǎn)品的農(nóng)藥提取大大增強了回收率，同時顯著縮短了樣品制備的處理時間。

在這項新的研究中（由Spex和HoppeSyler共同進行的聯(lián)合項目），使用手動小球攪拌器和自動化均質(zhì)器（Spex Genomax）來破壞各種生物組織，然后在進行基因組DNA（gDNA）分離之前。分離的gDNA隨后用于下游敏感的應(yīng)用中，以確定手動與自動均質(zhì)器在分析學(xué)和分子生物學(xué)研究中的有效性。

1 方法和材料

該工作流程主要涉及三個過程：1. 組織均質(zhì)化；2. DNA提��；3. DNA分離。

組織均質(zhì)化

將60毫克的新鮮組織加入500微升的DNA結(jié)合緩沖液和20微升的蛋白酶K（20 mg/mL），這些試劑來自Spex DNAmax動物基因組DNA分離試劑盒。根據(jù)制造商的協(xié)議進行組織的均質(zhì)化和處理。然后將樣品在55ºC下以700 rpm的速度輕輕搖動15分鐘進行孵育。在蛋白酶K消化后，向裂解物中加入20微升的RNase A，并在室溫下孵育五分鐘，然后加入200微升的>95%乙醇。然后通過渦旋器將裂解物劇烈混合五秒鐘。

DNA提取和柱清洗

渦旋后，將700µL裂解物加載到DNAmax試劑盒提供的硅膠旋轉(zhuǎn)柱上，并在室溫下以13,000 xg離心一分鐘。丟棄流過液，并將500µL來自試劑盒的洗滌緩沖液A（添加了乙醇）添加到柱中，再次離心三分鐘。丟棄所得的流過液。

DNA分離和洗脫

將柱子離心額外一分鐘，并丟棄收集管。向柱子中加入100 µL的EB或TE緩沖液（pH 8.0），并在室溫下靜置三分鐘，然后再次離心一分鐘。收集含有純化的gDNA的流過液進行分析和qPCR。

手動 VS Genomax：核酸分離和回收

在比較手動和自動研磨的第一次研究中，各種動物組織（牛里脊肉、雞胸肉和小鼠心臟）的樣品經(jīng)過均質(zhì)化、提取和分離gDNA的處理。使用手動均質(zhì)化的樣品平均處理時間超過200分鐘（接近2個半小時），而使用Spex Genomax的時間不到1/2小時（圖1）。使用自動化的Genomax方法，處理時間減少了超過86%。

圖1. 使用手動和Genomax處理gDNA均質(zhì)化、提取和分離的處理時間
 

比較了三種動物組織（牛里脊肉、雞胸肉和小鼠心臟）中提取的遺傳物質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量。牛里脊肉和雞胸肉代表了不同密度的動物肌肉組織。小鼠心臟代表了難以均質(zhì)化的纖維狀動物器官組織。傳統(tǒng)上，高密度和纖維狀組織最難均質(zhì)化，并且產(chǎn)生的可回收gDNA量最少。使用手動方法和Genomax處理后，分離gDNA并使用紫外/可見光譜法測試濃度（圖2）。

圖2. 使用手動和Genomax方法在不同動物組織中回收DNA

手動方法通常會導(dǎo)致DNA提取和分離不完整，而使用Genomax進行自動化均質(zhì)化手動方法通常會導(dǎo)致DNA提取和分離不完整，而使用Genomax進行自動化均質(zhì)化可以實現(xiàn)完荃的均質(zhì)化和高效的提取，如圖3中的電泳凝膠所示。

圖3. 使用手動和Genomax自動化均質(zhì)化處理的DNA的凝膠電泳

在這項首次研究的一項后續(xù)研究中，使用商用手動小球混合器和Spex Genomax均質(zhì)器對30毫克的小鼠心臟進行均質(zhì)化。根據(jù)制造商的建議，使用手動均質(zhì)器對小鼠心臟進行均質(zhì)化，而Genomax中的組織則經(jīng)過三輪均質(zhì)化處理，每輪以1500 rpm的速度均質(zhì)化1分鐘，每輪之間有20秒的暫停。使用Spex DNAmax試劑盒分離DNA，并使用涵蓋小鼠Ostβ啟動子或Hic1基因體的引物制備用于qPCR分析的樣品。每個分析都進行了雙重檢測。與手動均質(zhì)化相比，發(fā)現(xiàn)Genomax的產(chǎn)量增加了35倍。實際上，在使用0.25 µL至1 µL的分離gDNA時，Genomax樣品產(chǎn)生了強烈的曲線，而使用手動均質(zhì)器分離的gDNA生成了1 µL的擴增曲線（圖4）。

圖4. 小鼠有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運β啟動子的復(fù)制。9號染色體，65330248-65330323(75個堿基對) ，使用Genomax和手動處理

使用較小體積的gDNA（0.25 µL和0.5 µL）時，目標(biāo)基因的擴增在使用Genomax時被證明是成功的，而通過手動處理分離的gDNA未能產(chǎn)生任何信號（圖5）。

圖5. 低樣品體積下，使用手動方法和Genomax復(fù)制小鼠高甲基化癌癥1基因體的結(jié)果對比。染色體11，75058091-75058200（109個堿基對）

2 結(jié)論

自動化的均質(zhì)化和細胞裂解過程提高了處理的效率，無論是在時間上還是在最終的gDNA提取上。使用Genomax等自動化過程，目標(biāo)gDNA的質(zhì)量和數(shù)量以及復(fù)制性都顯著提高，特別是與Spex DNAmax提取試劑盒結(jié)合使用時�？傮w而言，使用Genomax處理樣本的時間大大減少到不到半小時，并且在較低的樣品體積下產(chǎn)生更多可復(fù)制的遺傳物質(zhì)副本。