聚苯乙烯顆粒塑料污染對下一代的影響詳解
對塑料污染的研究表明，這種威脅對我們星球的危險程度正在與日俱增。海洋是絕大多數(shù)塑料垃圾的最終目的地。聚苯乙烯是熱塑性聚合物中使用最廣泛的塑料之一，也是環(huán)境中觀察到的塑料碎片的主要成分之一，它可用于食品服務和食品包裝，因此可以直接包含在食物鏈中。在這項研究中，在胚胎期注射20納米大小的聚苯乙烯顆粒（PS）的斑馬魚在沒有塑料暴露的環(huán)境中生長，在形態(tài)、分子和代謝組學水平上研究聚苯乙烯顆粒對其后代胚胎/幼魚的影響。
1.材料和方法
1.1斑馬魚飼養(yǎng)和PNP處理
試驗中使用斑馬魚，總共300個胚胎，每次復制100個胚胎，注射聚苯乙烯納米塑料（PNP）。此外，用注射超純水的胚胎作為對照組。將注射的和對照的胚胎保存在胚胎培養(yǎng)基和28.5度的培養(yǎng)箱中直到第6天。從第6天開始，幼魚被帶到系統(tǒng)中的特殊幼魚槽中，并用特殊的幼魚飼料喂養(yǎng)到第15天。從第15天開始，每天給它們喂食并生長6個月。直到6個月，注射PNP的斑馬魚的存活率與對照組相比沒有觀察到顯著差異。從對照組和注射組中隨機選擇10只雌性和20只雄性6個月大的斑馬魚，將它們放入繁殖池中，每個繁殖池中有2只雄性和1只雌性。每組至少獲得700個胚胎用于每次復制。將后代胚胎取入E3胚胎培養(yǎng)基中，觀察至第120小時。每24小時記錄一次所有后代斑馬魚的存活率、孵化率和身體異常。
1.2心跳、血流和運動活性測定
對于心跳和血流分析，從對照組和PNP治療組中隨機選擇10個120小時胚胎，在顯微鏡下進行180秒的視頻記錄。視頻聚焦于心臟的心跳和尾靜脈的血流，然后轉(zhuǎn)移到諾達思的斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)進行分析。所有實驗分三個重復進行。對于運動活性，從對照組和PNP處理組中隨機選擇24只幼魚，每只120小時，將其放置在24孔板上，每個孔中有一只幼魚，并將板放置在諾達思的斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)中。在馴化30分鐘后，將該系統(tǒng)調(diào)節(jié)至10分鐘間隔的黑暗和光明期50分鐘。在分析期間，通過動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)評估幼魚的運動活動。對每組進行三次重復的72只幼魚進行分析。
1.3全程免疫熒光幼魚染色
為了研究親代PNP暴露對后代自由基形成、細胞凋亡和脂質(zhì)積累的影響，將達到120小時的新一代幼魚作為整體免疫熒光進行分析。
1.4代謝組學
將來自對照組和PNP組的25個120hpf胚胎匯集在1ml微量離心管中（每組10個）。加入1ml甲醇以維持均化過程。之后，將提取物置于水浴中超聲處理約10分鐘。最后，將所有樣品以離心10分鐘。將上清液輕輕轉(zhuǎn)移到另一個微型離心管中，并在真空下抽吸直至干燥。通過100μl流動相（去離子水：乙腈，包括%0.1甲酸）對樣品進行重組。
2.結(jié)果和討論
根據(jù)本研究獲得的結(jié)果，觀察到與對照組相比，親代PNP暴露導致下一代幼魚的總體畸形（包括心包水腫、卵黃囊水腫、身體畸形/彎曲體軸）顯著增加（圖1 a和b段）。與注射胚胎（父母）相比，在后代幼魚中觀察到的畸形率低于在注射幼魚中觀察的畸形率（圖1b段）。同樣，觀察到親代PNP暴露會增加下一代幼魚的死亡率（圖1c），但考慮到注射的胚胎（親代），觀察到下一代幼體的存活率高于注射PNP的胚胎（父母）。另一方面，與對照組相比，孵化率沒有差異（圖1d）。PNP組的心包區(qū)域明顯增加（圖1e）。這種增加支持了觀察到的心包水腫。
在本研究中，為了闡明在胚胎早期暴露于PNP的斑馬魚后代中觀察到的這些形態(tài)學、生理學和分子損傷的潛在機制，通過化學計量分析評估Q-TOF MS/MS光譜來進行代謝組分析。在圖中，各組之間存在一定差異（圖3a段）。圖3b中，有兩個主要集群，發(fā)現(xiàn)對照組和PNP組之間存在顯著差異。這些代謝物可能因投影變量（VIP）得分而顯著變化（圖3c段）。在圖3c中，下調(diào)和上調(diào)的代謝物分別被闡明為紅色和藍色。根據(jù)分析結(jié)果，確定酪氨酸、不飽和脂肪酸代謝、葉酸生物合成和精氨酸-脯氨酸代謝受到嚴重影響（圖3d）。
代謝組結(jié)果表明，與多巴胺合成密切相關(guān)的3-甲氧基酪胺（3-MT）和高香草酸（HVA）水平在PNP組中顯著上調(diào)（圖3c）。3-MT是多巴胺的主要代謝產(chǎn)物，而HVA是多巴胺分解代謝的主要代謝物。兩種化合物水平的共同增加表明，這可能是與RET原癌基因、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤類型、Von Hippel-Lindau和整合膜蛋白相關(guān)的幾個基因發(fā)生遺傳突變的跡象。較低的多巴胺水平和誘導分解代謝機制可能導致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。此外，研究表明，多巴胺在腫瘤組織中的濃度低于良性組織，甚至通過多巴胺治療可以減少慢性應激介導的血管生成，從而阻止腫瘤細胞增殖。
甲基糖胺（creatin），與生物體內(nèi)的許多過程有關(guān)，包括生理、神經(jīng)、免疫和代謝，被確定為PNP組中具有最高顯著性的上調(diào)代謝產(chǎn)物（圖3c）。高肌酸水平是腎/肌肉疾病和腎功能障礙的標志。此外，這種肌肉廢物可能導致血管損傷和高血壓。當評估高血流量和心率以及高肌酸水平時（圖1和圖3），我們可以說父母PNP暴露顯著影響下一代。
為了在分子水平上評估這些癌癥相關(guān)代謝物水平的變化，對幼魚進行組織病理學和免疫組織化學（使用JNK、NOP10、PI3和H2A.X生物標志物）分析，并搜索癌癥結(jié)果。根據(jù)組織病理學結(jié)果，在PS組的幼魚中發(fā)現(xiàn)了嚴重的神經(jīng)元變性和壞死，特別是在腦組織中，以及血管中具有核多態(tài)性的非典型、深染、增生細胞（圖4）。另一方面，根據(jù)免疫組織化學分析結(jié)果，在PS組幼魚中檢測到顯著更高的免疫陽性率，特別是在腦組織JNK和H2A.X表達中，以及在血管中檢測到的非典型細胞中NOP10和PI3表達中（圖4）。研究表明，JNK與惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤生長有關(guān)。另一方面，據(jù)報道，NOP10的表達水平在腫瘤組織中顯著增加，是轉(zhuǎn)移形成的重要標志物。磷脂酰肌醇3（PI3）激酶是一種重要的酶，在細胞生長、增殖、代謝活性、存活和血管生成中發(fā)揮作用。涉及該酶的病理激活涉及多種機制，如腫瘤抑制基因的突變和失活。此外，PS組H2A.X免疫陽性率增加也是DNA損傷的重要指標。在PS組中觀察到的神經(jīng)元損傷和JNK表達也可以被評估為細胞凋亡增加的指標。氧化應激和隨后由于抗氧化防御系統(tǒng)不足而導致的自由氧物種增加所引起的不可逆損傷將導致細胞凋亡增加。因此，根據(jù)全身免疫熒光幼魚染色的結(jié)果（圖2），在PNP組中觀察到的細胞死亡和自由氧自由基數(shù)量的顯著增加支持了這些發(fā)現(xiàn)。盡管這些不足以直接診斷癌癥，但它們提供了支持癌癥發(fā)現(xiàn)的重要初步信息。
至于下調(diào)的代謝產(chǎn)物，在PNP組中檢測到的低肌苷一磷酸（IMP）水平與能量代謝失調(diào)有關(guān)，可能解釋生長遲緩導致的眼睛大小、身體長度和運動活性的差異。PNP組的亞油酸、油酸和二十二碳六烯酸水平顯著較低。這些分子被稱為不飽和脂肪酸（UFA），在細胞膜中發(fā)揮重要作用，用作能量儲存，并參與基因表達和蛋白質(zhì)合成。膽固醇是脂質(zhì)組織最重要的調(diào)節(jié)因子之一，是PNP組中另一種顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物。當將這些發(fā)現(xiàn)與全株免疫熒光幼魚染色分析的脂質(zhì)積累結(jié)果一起評估時（圖2），我們可以說，親代PNP暴露會導致下一代脂質(zhì)代謝惡化。
3.結(jié)論
父母接觸聚苯乙烯納米塑料會導致下一代幼魚生長遲緩，包括畸形、存活率下降、心率和血流量增加，以及眼睛大小、身高和運動能力下降。根據(jù)全山免疫熒光幼魚染色的結(jié)果，注射PNP的斑馬魚新一代幼魚的細胞死亡和活性氧物種顯著增加，而脂質(zhì)積累減少。根據(jù)代謝組學結(jié)果，檢測到了OPLS-DA分析提出的28個注釋代謝組。此外，還發(fā)現(xiàn)新一代幼魚的組織病理學表現(xiàn)和JNK、H2A.X、PI3和NOP10的免疫陽性率顯著增加。總之，研究表明，即使僅在胚胎期暴露于PS，也可能影響下一代許多與癌癥相關(guān)的過程。
參考文獻
Sulukan E, Şenol O, Baran A, et al. Nano-sized polystyrene plastic particles affect many cancer-related biological processes even in the next generations; zebrafish modeling[J]. Science of The Total Environment, 2022, 838: 156391.
1.材料和方法
1.1斑馬魚飼養(yǎng)和PNP處理
試驗中使用斑馬魚，總共300個胚胎，每次復制100個胚胎，注射聚苯乙烯納米塑料（PNP）。此外，用注射超純水的胚胎作為對照組。將注射的和對照的胚胎保存在胚胎培養(yǎng)基和28.5度的培養(yǎng)箱中直到第6天。從第6天開始，幼魚被帶到系統(tǒng)中的特殊幼魚槽中，并用特殊的幼魚飼料喂養(yǎng)到第15天。從第15天開始，每天給它們喂食并生長6個月。直到6個月，注射PNP的斑馬魚的存活率與對照組相比沒有觀察到顯著差異。從對照組和注射組中隨機選擇10只雌性和20只雄性6個月大的斑馬魚，將它們放入繁殖池中，每個繁殖池中有2只雄性和1只雌性。每組至少獲得700個胚胎用于每次復制。將后代胚胎取入E3胚胎培養(yǎng)基中，觀察至第120小時。每24小時記錄一次所有后代斑馬魚的存活率、孵化率和身體異常。
1.2心跳、血流和運動活性測定
對于心跳和血流分析，從對照組和PNP治療組中隨機選擇10個120小時胚胎，在顯微鏡下進行180秒的視頻記錄。視頻聚焦于心臟的心跳和尾靜脈的血流，然后轉(zhuǎn)移到諾達思的斑馬魚微視行為分析系統(tǒng)進行分析。所有實驗分三個重復進行。對于運動活性，從對照組和PNP處理組中隨機選擇24只幼魚，每只120小時，將其放置在24孔板上，每個孔中有一只幼魚，并將板放置在諾達思的斑馬魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)中。在馴化30分鐘后，將該系統(tǒng)調(diào)節(jié)至10分鐘間隔的黑暗和光明期50分鐘。在分析期間，通過動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)評估幼魚的運動活動。對每組進行三次重復的72只幼魚進行分析。
1.3全程免疫熒光幼魚染色
為了研究親代PNP暴露對后代自由基形成、細胞凋亡和脂質(zhì)積累的影響，將達到120小時的新一代幼魚作為整體免疫熒光進行分析。
1.4代謝組學
將來自對照組和PNP組的25個120hpf胚胎匯集在1ml微量離心管中（每組10個）。加入1ml甲醇以維持均化過程。之后，將提取物置于水浴中超聲處理約10分鐘。最后，將所有樣品以離心10分鐘。將上清液輕輕轉(zhuǎn)移到另一個微型離心管中，并在真空下抽吸直至干燥。通過100μl流動相（去離子水：乙腈，包括%0.1甲酸）對樣品進行重組。
2.結(jié)果和討論
根據(jù)本研究獲得的結(jié)果，觀察到與對照組相比，親代PNP暴露導致下一代幼魚的總體畸形（包括心包水腫、卵黃囊水腫、身體畸形/彎曲體軸）顯著增加（圖1 a和b段）。與注射胚胎（父母）相比，在后代幼魚中觀察到的畸形率低于在注射幼魚中觀察的畸形率（圖1b段）。同樣，觀察到親代PNP暴露會增加下一代幼魚的死亡率（圖1c），但考慮到注射的胚胎（親代），觀察到下一代幼體的存活率高于注射PNP的胚胎（父母）。另一方面，與對照組相比，孵化率沒有差異（圖1d）。PNP組的心包區(qū)域明顯增加（圖1e）。這種增加支持了觀察到的心包水腫。
圖1
在PNP組中觀察到眼睛大小和身體長度顯著減少（圖1f和g）。雖然已經(jīng)確定親代PNP暴露會導致后代幼魚的血流量和心率增加，但根據(jù)運動活動的結(jié)果，觀察到它會導致黑暗期的運動減少（圖1h–k）。另一方面，根據(jù)整株免疫熒光幼魚染色結(jié)果，親代PNP暴露導致下一代幼魚的細胞死亡和自由氧自由基數(shù)量增加（圖2）。另一方面，由于脂質(zhì)代謝的不規(guī)則性，檢測到脂質(zhì)積累顯著減少（圖2）。
圖2
在本研究中，為了闡明在胚胎早期暴露于PNP的斑馬魚后代中觀察到的這些形態(tài)學、生理學和分子損傷的潛在機制，通過化學計量分析評估Q-TOF MS/MS光譜來進行代謝組分析。在圖中，各組之間存在一定差異（圖3a段）。圖3b中，有兩個主要集群，發(fā)現(xiàn)對照組和PNP組之間存在顯著差異。這些代謝物可能因投影變量（VIP）得分而顯著變化（圖3c段）。在圖3c中，下調(diào)和上調(diào)的代謝物分別被闡明為紅色和藍色。根據(jù)分析結(jié)果，確定酪氨酸、不飽和脂肪酸代謝、葉酸生物合成和精氨酸-脯氨酸代謝受到嚴重影響（圖3d）。
圖3
代謝組結(jié)果表明，與多巴胺合成密切相關(guān)的3-甲氧基酪胺（3-MT）和高香草酸（HVA）水平在PNP組中顯著上調(diào)（圖3c）。3-MT是多巴胺的主要代謝產(chǎn)物，而HVA是多巴胺分解代謝的主要代謝物。兩種化合物水平的共同增加表明，這可能是與RET原癌基因、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤類型、Von Hippel-Lindau和整合膜蛋白相關(guān)的幾個基因發(fā)生遺傳突變的跡象。較低的多巴胺水平和誘導分解代謝機制可能導致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。此外，研究表明，多巴胺在腫瘤組織中的濃度低于良性組織，甚至通過多巴胺治療可以減少慢性應激介導的血管生成，從而阻止腫瘤細胞增殖。
甲基糖胺（creatin），與生物體內(nèi)的許多過程有關(guān)，包括生理、神經(jīng)、免疫和代謝，被確定為PNP組中具有最高顯著性的上調(diào)代謝產(chǎn)物（圖3c）。高肌酸水平是腎/肌肉疾病和腎功能障礙的標志。此外，這種肌肉廢物可能導致血管損傷和高血壓。當評估高血流量和心率以及高肌酸水平時（圖1和圖3），我們可以說父母PNP暴露顯著影響下一代。
為了在分子水平上評估這些癌癥相關(guān)代謝物水平的變化，對幼魚進行組織病理學和免疫組織化學（使用JNK、NOP10、PI3和H2A.X生物標志物）分析，并搜索癌癥結(jié)果。根據(jù)組織病理學結(jié)果，在PS組的幼魚中發(fā)現(xiàn)了嚴重的神經(jīng)元變性和壞死，特別是在腦組織中，以及血管中具有核多態(tài)性的非典型、深染、增生細胞（圖4）。另一方面，根據(jù)免疫組織化學分析結(jié)果，在PS組幼魚中檢測到顯著更高的免疫陽性率，特別是在腦組織JNK和H2A.X表達中，以及在血管中檢測到的非典型細胞中NOP10和PI3表達中（圖4）。研究表明，JNK與惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤生長有關(guān)。另一方面，據(jù)報道，NOP10的表達水平在腫瘤組織中顯著增加，是轉(zhuǎn)移形成的重要標志物。磷脂酰肌醇3（PI3）激酶是一種重要的酶，在細胞生長、增殖、代謝活性、存活和血管生成中發(fā)揮作用。涉及該酶的病理激活涉及多種機制，如腫瘤抑制基因的突變和失活。此外，PS組H2A.X免疫陽性率增加也是DNA損傷的重要指標。在PS組中觀察到的神經(jīng)元損傷和JNK表達也可以被評估為細胞凋亡增加的指標。氧化應激和隨后由于抗氧化防御系統(tǒng)不足而導致的自由氧物種增加所引起的不可逆損傷將導致細胞凋亡增加。因此，根據(jù)全身免疫熒光幼魚染色的結(jié)果（圖2），在PNP組中觀察到的細胞死亡和自由氧自由基數(shù)量的顯著增加支持了這些發(fā)現(xiàn)。盡管這些不足以直接診斷癌癥，但它們提供了支持癌癥發(fā)現(xiàn)的重要初步信息。
圖4
至于下調(diào)的代謝產(chǎn)物，在PNP組中檢測到的低肌苷一磷酸（IMP）水平與能量代謝失調(diào)有關(guān)，可能解釋生長遲緩導致的眼睛大小、身體長度和運動活性的差異。PNP組的亞油酸、油酸和二十二碳六烯酸水平顯著較低。這些分子被稱為不飽和脂肪酸（UFA），在細胞膜中發(fā)揮重要作用，用作能量儲存，并參與基因表達和蛋白質(zhì)合成。膽固醇是脂質(zhì)組織最重要的調(diào)節(jié)因子之一，是PNP組中另一種顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物。當將這些發(fā)現(xiàn)與全株免疫熒光幼魚染色分析的脂質(zhì)積累結(jié)果一起評估時（圖2），我們可以說，親代PNP暴露會導致下一代脂質(zhì)代謝惡化。
3.結(jié)論
父母接觸聚苯乙烯納米塑料會導致下一代幼魚生長遲緩，包括畸形、存活率下降、心率和血流量增加，以及眼睛大小、身高和運動能力下降。根據(jù)全山免疫熒光幼魚染色的結(jié)果，注射PNP的斑馬魚新一代幼魚的細胞死亡和活性氧物種顯著增加，而脂質(zhì)積累減少。根據(jù)代謝組學結(jié)果，檢測到了OPLS-DA分析提出的28個注釋代謝組。此外，還發(fā)現(xiàn)新一代幼魚的組織病理學表現(xiàn)和JNK、H2A.X、PI3和NOP10的免疫陽性率顯著增加。總之，研究表明，即使僅在胚胎期暴露于PS，也可能影響下一代許多與癌癥相關(guān)的過程。
參考文獻
Sulukan E, Şenol O, Baran A, et al. Nano-sized polystyrene plastic particles affect many cancer-related biological processes even in the next generations; zebrafish modeling[J]. Science of The Total Environment, 2022, 838: 156391.
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