非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病的發(fā)展密切相關(guān)，并且是許多晚期肝病的主要因素。NAFLD的全球發(fā)病率超過(guò)25%，且正在迅速增加，已成為危害人類健康的重大代謝性疾病。非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是NAFLD的晚期階段，在NAFLD中的發(fā)病率約為25-30%。針對(duì)NAFLD / NASH，目前尚無(wú)既定療法或FDA批準(zhǔn)的藥物，其發(fā)病機(jī)理和潛在機(jī)制也大多未知。因此，探究并確定一種新的藥理方法用于NAFLD / NASH的有效臨床治療是至關(guān)重要的。

 

2022年11月，深圳大學(xué)蘇文研究員、華東師范大學(xué)張曉燕教授與大連醫(yī)科大學(xué)管又飛教授團(tuán)隊(duì)，在Nature Communications上發(fā)表題為“Phosphorylation of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 13 at serine 33 attenuates nonalcoholic fatty liver disease in mice”的文章，揭示了17β-HSD13的蛋白磷酸化對(duì)肝細(xì)胞脂滴代謝的重要調(diào)控機(jī)制，并提出了一種新的靶向治療NAFLD方案。已有研究證明新型肝脂滴蛋白17β-HSD13（屬于17β類固醇脫氫酶），特異性表達(dá)于肝臟脂滴表面，其過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)脂肪肝的發(fā)生和發(fā)展，提示17β-HSD13可能在脂肪肝的干預(yù)治療中具有重要價(jià)值，但其確切功能及相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本文研究中該聯(lián)合團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞內(nèi)17β-HSD13和肝臟重要水解酶——脂肪甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）及其輔因子CGI-58（Comparative gene identification 58）三者間存在動(dòng)態(tài)的結(jié)合，PKA信號(hào)通路的激活可以使17β-HSD13的絲氨酸33位磷酸化，從而增加CGI-58對(duì)ATGL的激活，進(jìn)而促進(jìn)脂滴中甘油三酯的水解和線粒體的β-氧化，從而改善肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的積累。

為了研究17β-HSD13絲氨酸33位磷酸化與NAFLD的功能相關(guān)性，研究人員使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了33位丙氨酸替代的絲氨酸表達(dá)失活型(S33A)小鼠模型Hsd17B1^333A/A，并與野生型（Wild type，WT）對(duì)照組小鼠Hsd17b1^3+/+共同飼養(yǎng)5個(gè)月，Hsd17B1^333A/A小鼠出現(xiàn)顯著的脂肪肝表型，經(jīng)H&E和油紅O染色切片掃描（由芬蘭Grundium的Ocus便攜式數(shù)字病理切片顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描），結(jié)果顯示Hsd17B1^333A/A小鼠的肝部中央靜脈區(qū)域大量蓄積更大尺寸的肝細(xì)胞脂滴，同時(shí)IHC結(jié)果也顯示F4/80+和CD68+細(xì)胞浸潤(rùn)（如圖1紅框）。結(jié)合其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)，證明17β-HSD13的絲氨酸33位磷酸化障礙促進(jìn)了正常飲食小鼠的肝臟脂質(zhì)積累和炎癥發(fā)生。

之后，為確定脂滴水解功能障礙是否會(huì)促進(jìn)NASH的發(fā)生和發(fā)展，研究人員用高脂肪飲食（High-fat diet，HFD）喂養(yǎng)Hsd17b1^3+/+和Hsd17b1^333A/A小鼠3個(gè)月。經(jīng)組織學(xué)檢查、油紅O和Masson染色分析，Hsd17b1^333A/A小鼠比Hsd17b1^3+/+小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的肝臟脂質(zhì)積累、肝細(xì)胞氣球化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積癥狀，IHC掃描結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，Hsd17b1^333A/A小鼠的肝臟炎癥和纖維化進(jìn)程顯著加快（如圖2）。利用腺病毒載體AAV在小鼠肝內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行協(xié)同驗(yàn)證，得到類似結(jié)果（如圖3）。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明了Ser33殘基是17β-HSD13重要的磷酸化位點(diǎn)，并可能參與到ATGL依賴型脂肪水解的調(diào)控中，Ser33殘基的靶向突變促進(jìn)了NASH的發(fā)展。

在獲得17β-HSD13絲氨酸33位磷酸化調(diào)控NALFD的相關(guān)結(jié)論后，研究人員通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，從FDA批準(zhǔn)的小分子藥物庫(kù)中篩選出干預(yù)NAFLD的潛在藥物—原用于治療哮喘的瑞普特羅。繼而單獨(dú)對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行瑞普特羅給藥，油紅O、H&E和Masson染色相關(guān)研究結(jié)果顯示，相比對(duì)照組HF-Ctrl，實(shí)驗(yàn)組小鼠HF-R的肝臟脂滴大小和數(shù)量均顯著減少（如圖4）。同時(shí)結(jié)合蛋白和酯類的表達(dá)分析，瑞普特羅可以通過(guò)激活PKA信號(hào)通路增加17β-HSD13絲氨酸33位的磷酸化，并抑制NALFD的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)一步提示靶向17β-HSD13絲氨酸33位磷酸化可能是干預(yù)NAFLD的潛在藥物靶點(diǎn)。

綜上所述，此項(xiàng)研究證實(shí)了17β-HSD13是PKA新的磷酸化底物，闡明了17β-HSD13絲氨酸33位磷酸化在調(diào)控肝臟脂滴代謝中的重要作用，揭示了PKA / 17β-HSD13 / ATGL信號(hào)軸在干預(yù)脂肪肝發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制，為靶向17β-HSD13治療NAFLD及相關(guān)代謝疾病提供了重要的理論基礎(chǔ)。

文章中小鼠病理組織經(jīng)H&E染色、油紅O染色、IHC免疫組化及Masson染色后，均使用芬蘭Grundium公司生產(chǎn)的OCUS便攜式數(shù)字病理切片顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

 

芬蘭Grundium公司自主研發(fā)和生產(chǎn)了全球領(lǐng)先的便攜式數(shù)字病理掃描顯微成像系統(tǒng)--Ocus。設(shè)備具有雙層可移動(dòng)載物臺(tái)，根據(jù)自動(dòng)圈選的區(qū)域，結(jié)合專利的軟件算法采取螺旋路徑等非直線掃描模式，快速完成掃描。Ocus每個(gè)視野獨(dú)立自動(dòng)對(duì)焦，可有效避免切片厚薄不均導(dǎo)致的圖像問(wèn)題，且采集的圖片自動(dòng)無(wú)縫拼接生成超高清圖片，不遺漏任何有價(jià)值的信息。Ocus的訪問(wèn)和操作均采用瀏覽器模式，通過(guò)有線、無(wú)線或Ocus自帶熱點(diǎn)的鏈接，無(wú)需安裝額外的軟件或app，通過(guò)手機(jī)、Pad或電腦即可實(shí)現(xiàn)儀器的訪問(wèn)和操控。同時(shí)機(jī)器整合了現(xiàn)代的通訊技術(shù)，支持多人實(shí)時(shí)共享高清圖片和遠(yuǎn)程操控儀器，讓遠(yuǎn)程會(huì)診、學(xué)術(shù)交流和教育更加便利。

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