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                                當前位置 > 首頁 > 技術(shù)文章 > 熒光顯微鏡應(yīng)用于外泌體分泌動力學(xué)溫度控制研究

                                熒光顯微鏡應(yīng)用于外泌體分泌動力學(xué)溫度控制研究

                                瀏覽次數(shù):568 發(fā)布日期:2023-9-25  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負
                                單分子熒光成像:外泌體分泌動力學(xué)受溫度控制
                                 

                                熒光顯微鏡的出現(xiàn),讓細胞器的觀察成為可能,而如果要觀察到更細致的目標,則需要做單分子熒光成像,今天我們就來分享一個今年用TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡做的單分子熒光成像研究:外泌體分泌動力學(xué)受溫度控制。

                                 

                                ·為什么使用TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡

                                 

                                全內(nèi)反射熒光顯微鏡MF53-TIRF
                                 

                                TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡是利用光線全反射后形成衰逝波特性,來實現(xiàn)薄區(qū)域熒光觀察的光學(xué)儀器,這種顯微鏡相比常規(guī)熒光顯微鏡(寬場熒光),背景熒光顯著更低,可以實現(xiàn)信噪比更高、細節(jié)更豐富的熒光成像,尤其適合應(yīng)用于細胞膜物質(zhì)的動態(tài)觀察。

                                 

                                衰逝波①
                                 

                                衰逝波是一種光學(xué)現(xiàn)象,當激發(fā)光以特定角度入射時,會發(fā)生全反射現(xiàn)象,所有激發(fā)光會被反射,靠近反射面的樣品面則會形成一個深度僅幾百納米,光強呈指數(shù)衰減的激發(fā)光,稱為衰逝波。


                                普通熒光成像與TIRF成像對比①
                                 

                                 利用衰逝波,TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡可以將激發(fā)范圍控制在樣品面極薄的區(qū)域,從而避免了傳統(tǒng)熒光顯微鏡焦面以外的熒光激發(fā)形成的模糊光暈,大大提升了信噪比和分辨率。由于衰逝波光強呈指數(shù)衰減,因此最合適的應(yīng)用是細胞膜相關(guān)研究。

                                 

                                ·外泌體分泌動力學(xué)受溫度控制
                                 

                                我們來看一個論文案例,從中了解TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡的應(yīng)用優(yōu)勢:超高分辨率、動態(tài)觀察。
                                 

                                使用CD63-pHluorin可視化pH敏感蛋白
                                 

                                 使用CD63-pHluorin可視化外泌體與質(zhì)膜融合過程。TIRF全內(nèi)反射熒光顯微鏡可以實現(xiàn)單分

                                動態(tài)跟蹤觀察,為此需要配備高幀率、高靈敏度的顯微鏡相機,比如MSH12之類背照式sCMOS科學(xué)相機。

                                 

                                按成像分析,區(qū)分外泌體不同活動方式②
                                 

                                 單分子熒光成像研究通常涉及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析等內(nèi)容,往往需要一定的算法設(shè)計來自動化分析和量化處理,比如本論文使用的就是MATLAB腳本,在github可以下載。

                                 

                                成像分析可靠性驗證,排除溶酶體或囊泡轉(zhuǎn)運②

                                 

                                通過成像分析CD63-pHluorin可視化外泌體與質(zhì)膜融合,排除溶酶體或囊泡轉(zhuǎn)運。
                                 

                                外泌體與質(zhì)膜融合有多種動力學(xué)模式②

                                 

                                算法分析,得出外泌體與質(zhì)膜融合有多種動力學(xué)模式。

                                 

                                 

                                外泌體與質(zhì)膜融合事件受溫度控制②

                                 

                                對不同動力學(xué)模式進行分析,顯示外泌體與質(zhì)膜融合事件受溫度控制。

                                 

                                模型驗證②

                                 

                                利用模型驗證解釋實驗觀察到的動力學(xué)。
                                 

                                進一步的動力學(xué)分析②

                                 

                                外泌體與質(zhì)膜融合前先有對接。

                                 

                                ·結(jié)尾

                                總體而言,全內(nèi)反射熒光顯微鏡MF53-TIRF是細胞表面物質(zhì)動態(tài)觀察的理想儀器,如固定在蓋玻片或細胞膜表面上的分子等,在TIRF基礎(chǔ)上明美還有dSTORM超分辨成像方案,有興趣的老師可以跟我們聯(lián)系。

                                 

                                如您對這篇論文感興趣,或者有興趣獲取論文使用的MATLAB自動分析處理腳本,請參考應(yīng)用來源部分信息②。

                                 

                                引用來源:

                                ①Fish KN. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. Curr Protoc. 2022 Aug;2(8):e517. doi: 10.1002/cpz1.517. PMID: 35972209; PMCID: PMC9522316.

                                 

                                ②Mahmood A, et al. Exosome secretion kinetics are controlled by temperature. Biophys J. 2023 Apr 4;122(7):1301-1314. doi: 10.1016/j.bpj.2023.02.025. Epub 2023 Feb 22. PMID: 36814381; PMCID: PMC10111348.

                                https://www.mshot.com/article/1828.html

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