一．原核誘導表達原理
一旦由lacI細胞所形成的阻遏蛋白與lac操縱子融合后，就無法影響外部基因的轉錄和表達了，也就從而保證了宿主細胞的健康生長。IPTG同時也是一種可以與乳糖水解融合的中間物質，它雖然無法被細胞所同化，但卻能夠與阻遏蛋白的結合，這樣細胞也就可以控制外源融資基因的大量轉錄和高效表達。
 
二．誘導表達的優(yōu)化策略
1.增加蛋白質溶解性和折疊：高溫易使蛋白質以聚集的形式表達成包涵體，可選擇低溫誘導表達。
2.提高翻譯水平：調整SD序列與AUG間的距離、點突變改變堿基、增加mRNA穩(wěn)定性。
3.減輕細胞的代謝負荷，提高表達水平：將細菌的生長與外源基因的誘導表達分開；使用化學誘導、溫度誘導等。
4.稀有密碼子優(yōu)化：多數(shù)氨基酸有一個以上的密碼子，當異源靶基因的mRNA異常表達后，tRNA的數(shù)量直接反應密碼子的偏好性，一個或多個tRNA的稀有或缺少會導致翻譯的停止。 

三．重組蛋白誘導表達實驗流程
（1）用適當?shù)南拗菩詢惹泻怂崦赶�化載體DNA和目的基因。
（2）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉化到轉化DH5α感受態(tài)細胞中。
（3）挑取陽性菌落將其加入至5mL Lb（0.1 g/l氨芐青霉素）內，在37℃培養(yǎng)下過夜。
（4）以2 %體積比轉接于2 mL LB( 0.1 g/L氨芐青霉素)中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h，至細菌對數(shù)生長期，加0.1 mmol/L IPTG 2 µL誘導3-4 h，同時設立不加IPTG誘導作為對照。
（5）取上述菌液1 mL，12000 rpm離心10min，收菌沉淀。
（6）重懸于冰的100 µL PBS中，加入PMSF至終濃度為10 mmoL/L。震蕩器震蕩混勻，加入2×加樣緩沖液，煮沸10 min變性，12,000 rpm離心10 min。
（7）將誘導的前后樣品各10µL，作SDS-PAGE電泳分析。
 
三. SDS-PAGE驗證蛋白表達純化結果1. SDS-PAGE實驗原理：
1.帶電粒子在電場中游動的速度與電場強度和帶電粒子的凈電荷成正比，與粒子半徑（分子量和結構）和介質的粘度成反比。如果試劑為混合蛋白質溶液，則各種蛋白質的等電點的原子數(shù)量不同，這樣在電泳時，產(chǎn)生了不同的電子遷移帶。
2. 實驗流程：
(1)凝膠的制備：配置分離膠，ddH2O 4.0mL，30%儲備膠3.3mL， 1.5M Tris-HCl 2.5mL，10%SDS 0.1mL，10%APS 0.1mL。將上述的混合物一mL后，用TEMED（N，N，N'N'-四亞甲基二胺）10個μL封住底部，再將余下的μL，拌和均勻后，以用百分之二十乙醇溶液填充的玻璃版，蒙頭頂部。確保液位是平的。濃縮膠用ddH2O 1.4mL，30%儲備膠0.33mL，1M Tris-HCl 0.25mL，10%SDS 0.02mL，10%APS 0.02mL，TEMED 2μL制備。去除或分離膠內的水分之后，再重新倒入混合物，然后迅速的把篦子放入玻璃內充分聚合，需時間約15-30min。
(2)加樣及電泳：將樣品中加入一定量的2xSDS緩沖液中，加熱3-5分鐘，于12000g時離心1分鐘，再取上等清液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將10uL誘導和未誘導處理的樣品加入樣品池中，并將蛋白質標記物加入相鄰泳道中。將電泳緩沖液注入電泳槽，并接通電源，濃縮膠的電壓約為80V，而分離膠電壓則是120V，溴酚藍到底時電泳結束。
(3)蛋白質的染色和脫色：將膠從玻璃板中取出，考馬斯亮藍染色液染色，室溫4-6 h。染色完畢后，將膠從染色液中取出，放入脫色液中，多次脫色至蛋白帶清晰。
(4）膠片攝像的保存：在圖像處理模式下將已經(jīng)脫色過的膠片攝像，結果保存于計算機中，而膠可保存于雙蒸水中。3. SDS-PAGE常見問題及解決方法

常見問題	出現(xiàn)原因	解決辦法
條帶拖尾	膠濃度過大/樣品溶解效果不好	樣品離心震蕩；電泳緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)配；降低凝膠濃度
中間凹兩邊翹	凝膠中間凝固不均勻	充分凝固后操作
中間凸兩邊凹	板間底部有氣泡	加適量緩沖液排除氣泡
條帶粗	未濃縮好	適當增加濃縮膠長度；保證電壓穩(wěn)定；保證儲液pH正確
加樣孔底部有沉淀	還原劑失活使蛋白質分子聚合成大分子	添加適量DTT或β-巰基乙醇；補充EDTA阻止還原劑氧化
出現(xiàn)紋理	樣品有不溶顆粒	加促溶劑/加樣前離心

4. 結果展示：
大小為43KDa的某融合蛋白原核誘導表達前后的SDS-PAGE結果： M：蛋白Marker；泳道1、3、5：3株單克隆菌株誘導前；泳道2、4、6：3株單克隆菌株誘導后。
 
五. 電泳技術的應用場景：
1.臨床醫(yī)學：電泳技術在臨床診斷中發(fā)揮重要作用，為檢測同工酶、各種蛋白質等提供了新手段。
2.生物制藥、藥物篩選與分析：分析生物樣本中的藥物及其代謝產(chǎn)物、分析藥物雜質、分析重要等。
3.食品安全及微生物鑒定：樣品條帶可反應不同樣品間的群落相似性，與飛行時間質譜、電化學檢測儀等結合使用，提高痕量檢測的可靠性。
4.農業(yè)畜牧業(yè)生產(chǎn)：可用于雜種后代的鑒定，親緣關系分析，遺傳基因定位等多種方面。
 
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