常州大學藥學院生物材料與納米醫(yī)學課題組負責人招秀伯教授利用MicroFab的Jetlab 4xL噴墨打印系統(tǒng)在RSF表面上圖案化自組裝的I3K肽納米纖維，以定向控制PC12細胞的生長。研究表明肽微圖案可以有效地引導RSF支架表面的細胞排列和組織，為神經(jīng)再生應(yīng)用提供了巨大的潛力。

介紹
人類神經(jīng)系統(tǒng)由中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）和外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）組成，它們很容易受到創(chuàng)傷和車禍等傷害以及阿爾茨海默病、帕金森病、中風和腦瘤等疾病的損害，開發(fā)用于神經(jīng)組織再生的明確功能支架以幫助指導神經(jīng)細胞附著、排列、擴散和增殖至關(guān)重要。微圖案化技術(shù)已經(jīng)引起了人們的關(guān)注，它可以實現(xiàn)神經(jīng)元細胞排列的幾何控制。噴墨打印是一種成本效益高且靈活的微圖案化技術(shù)，能夠以高精度圖案化復雜的幾何形狀。招秀伯教授團隊利用MicroFab的噴墨打印系統(tǒng)Jetlab 4xl在再生絲素蛋白（RSF）表面圖案化自組裝肽納米纖維，以指導神經(jīng)元PC12細胞的生長，如圖1所示。

▲ 圖1 微圖案引導細胞生長研究示意圖。
 

MicroFab的Jetlab 4xl噴墨打印系統(tǒng)配有60μm的噴頭，使用90V的電壓、300Hz的頻率打印I₃K肽納米纖維墨水，打印高度約為10mm。為了研究打印的I₃K肽納米纖維圖案對PC12細胞生長的影響，打印形成了圖案“SHEF”，如圖2所示。通過將自組裝的I₃K肽納米纖維噴墨打印到RSF基底上來對PC12細胞進行微圖案化，可以提供一種好的方法來分析體外軸突發(fā)育。
 

▲ 圖2 A. 使用I₃K肽（3mg/mL）作為墨水，在RSF涂層的玻璃表面（40mg/mL）上噴墨打印1層“SHEF”字母，PC12神經(jīng)元細胞沿著打印的字母生長；B. 放大的字母“HE”（比例尺500μm)。

細胞粘附過程的第一步是細胞-聚合物相互作用，這對細胞通訊、調(diào)節(jié)、組織發(fā)育和維持至關(guān)重要，通過AFM對附著在不同比例的RSF/I₃K支架上的細胞形態(tài)進行了研究，細胞在僅I₃K涂覆的表面上顯示出極好的鋪展如圖3a所示，而在僅RSF涂覆的表面幾乎沒有鋪展其末端如圖3b所示。圖3（d-g）通過將沉積在RSF（40mg/mL）涂層表面上的I₃K的濃度從2mg/mL增加到4mg/mL，細胞擴散顯著改善，表明細胞擴散的肽濃度依賴性。FITC、phalloidin和DAPI分別用于染色肌動蛋白絲和細胞核，以進一步表征粘附在RSF/I₃K支架上的細胞的形態(tài)，如圖4所示。
 

▲ 圖3 附著在一系列RSF和I₃K涂層表面的PC12神經(jīng)元細胞的AFM峰值力誤差圖像。
 

▲ 圖4 附著在不同比例RSF/I₃K涂層表面的PC12神經(jīng)元細胞的F-肌動蛋白染色。

PC12細胞在樣品表面（I型膠原；RSF；RSF/I₃K 40:3和RSF/I₃K 40:4）上的代謝活性在培養(yǎng)24、72和144小時后使用雷沙蘇林測定法測定，如圖5所示。在所有表面上觀察到代謝活性在24至144小時之間逐漸增加，對于RSF/I₃K支架，代謝活性增加更多，表明I₃K可以促進PC12細胞增殖，涂層表面上有極好的細胞增殖。

▲ 圖5 雷沙蘇林測定法評估粘附著在不同表面上的PC12細胞的代謝活性。

結(jié)論
使用I₃K肽納米纖維作為細胞吸引劑來修飾RSF支架表面，以促進神經(jīng)元細胞（PC12細胞）的附著和生長，I₃K肽的存在促進了PC12細胞的結(jié)合效率，帶正電荷的賴氨酸殘基促進了細胞附著。噴墨打印已被證明是用于引導細胞附著的好的微圖案方法，為分析和理解基本細胞功能（如軸突發(fā)育和細胞-細胞相互作用）提供了一種很有前途的方法。

參考文獻：
[1] Sun W ,  Taylor C S ,  Zhang Y , et al. Cell Guidance on Peptide Micropatterned Silk Fibroin Scaffolds[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2021, 603(6).