Nat Immunol | 研究人員發(fā)現(xiàn)調(diào)控NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的新機(jī)制

近年來，腫瘤免疫療法已廣泛應(yīng)用于癌癥的臨床治療中，各種類型的免疫細(xì)胞特別是那些可以通過細(xì)胞間接觸溶解靶細(xì)胞的免疫細(xì)胞受到了研究人員的重點(diǎn)關(guān)注。其中，由于自然殺傷細(xì)胞（NK）具有非特異性直接殺傷腫瘤細(xì)胞的特性，被認(rèn)為是人體抵抗癌細(xì)胞和病毒感染的第一道防線。許多研究表明，免疫突觸（IS）的形成是NK細(xì)胞清除靶細(xì)胞的關(guān)鍵，它們可以識別和消除病毒感染和轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞。盡管對IS的特征及其形成過程有了深入了解，但通過細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性的機(jī)制尚不清楚。

近期，韓國生物科學(xué)與生物技術(shù)研究院免疫治療研究中心的研究團(tuán)隊在著名期刊《Nature immunology》發(fā)表了題為“NgR1 is an NK cell inhibitory receptor that destabilizes the immunological synapse”的文章，他們報道了一種新型的NK細(xì)胞抑制性受體Nogo受體1（NgR1），它通過干擾接觸穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)IS形成來影響NK細(xì)胞對表達(dá)NogoA靶細(xì)胞的殺傷能力，并確定NgR1為IS形成過程中的免疫檢查點(diǎn)，提出了一個可用于改善腫瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

為了驗(yàn)證NgR1干擾NK細(xì)胞的抗腫瘤功能，該團(tuán)隊首先研究了NgR1在細(xì)胞表面的表達(dá)，結(jié)果顯示NgR1在多種免疫細(xì)胞中均有表達(dá)，如小鼠原代NK細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞和EL4細(xì)胞系（圖1a），而NgR1的配體NogoA在各種癌細(xì)胞系中表達(dá)。隨后，對NgR1是否參與免疫細(xì)胞的細(xì)胞溶解過程進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在NEP1-40（NgR1的拮抗肽）處理后，NgR1敲除小鼠（KO）的脾細(xì)胞比WT小鼠的脾細(xì)胞具有更高的細(xì)胞溶解能力（圖2c），并驗(yàn)證了NEP1-40的特異性（圖1d）。接下來，通過建立WT和KO小鼠肺轉(zhuǎn)移小鼠同基因模型（圖1e），進(jìn)一步證明了NK細(xì)胞中的NgR1對腫瘤生長具有負(fù)調(diào)控作用。此外，為了研究NgR1缺陷導(dǎo)致的抗腫瘤效果的改善是否源于免疫成分的內(nèi)在變化，對WT和KO小鼠的免疫細(xì)胞群進(jìn)行了分析（圖1h）。結(jié)果表明，NgR1缺陷并不影響免疫細(xì)胞的組成，提示NgR1主要參與NK細(xì)胞的效應(yīng)功能。

圖1 NgR1缺陷增強(qiáng)了NK細(xì)胞殺傷能力

在小鼠中，NgR1參與了NK細(xì)胞的腫瘤控制，因而在人類NK細(xì)胞中也可能具有重要的作用。作者發(fā)現(xiàn)，NgR1及其輔助受體在人體UCB-NK、PB-NK、MNK、NK92和Jurkat細(xì)胞系中都有表達(dá)（圖2a）。為研究NgR1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，使用Nogo-P4（NgR1激動肽）在NK細(xì)胞中激活了NgR1，發(fā)現(xiàn)在NK92細(xì)胞和UCB-NK細(xì)胞中，RhoA和LIMK都被激活，而Cofilin失活（圖2b）。RhoA的激活通過肌動球蛋白的收縮和粘連蛋白的失活來促進(jìn)應(yīng)力纖維的形成，導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架重組。且F-肌動蛋白的積聚會引起細(xì)胞膜突起的形成，從而影響細(xì)胞的遷移和黏附。通過在表達(dá)Lifeact-GFP的NK92細(xì)胞中直接顯示F-肌動蛋白，并使用視頻顯微鏡觀察Nogo-P4處理對F-肌動蛋白動態(tài)變化的影響。結(jié)果表明，經(jīng)過Nogo-p4處理的NK92細(xì)胞中F-肌動蛋白強(qiáng)度和膜突出頻率都顯著增強(qiáng)（圖2c、d、e）。這些數(shù)據(jù)表明，NK細(xì)胞中的NgR1通過RhoA信號調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架。

圖2 NgR1促進(jìn)NK細(xì)胞F-肌動蛋白聚合

隨后，為了評估NgR1在NK細(xì)胞殺傷中的特異性，作者通過調(diào)節(jié)NK細(xì)胞或靶細(xì)胞中NgR1的表達(dá)來探究NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用。在幾乎不表達(dá)NogoA的腫瘤細(xì)胞中，使用或不使用NEP1-40阻斷NgR1對NK的殺傷效果沒有差異（圖3a）。而在過表達(dá)NogoA的K562腫瘤細(xì)胞中，NK介導(dǎo)的殺傷效果顯著降低，并可以被NEP1-40所挽救（圖3b、c）。在用NEP1-40處理后，NK細(xì)胞對U87MG細(xì)胞的細(xì)胞毒性增強(qiáng)（U87MG細(xì)胞是一種已知高表達(dá)NogoA35的腦瘤細(xì)胞系）（圖3d）。并且當(dāng)抑制U87MG細(xì)胞中NogoA的表達(dá)或NK92細(xì)胞中NgR1的表達(dá)時，同樣會增強(qiáng)NK細(xì)胞毒性（圖3e、f）。因此，上述結(jié)果表明，在NogoA存在的情況下，NgR1對NK細(xì)胞的細(xì)胞溶解功能具有抑制作用。

值得一提的是，為了在K562細(xì)胞中過表達(dá)NogoA和在NK92細(xì)胞中抑制NgR1的表達(dá)，研究人員使用了NEPA GENE公司的NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)分別對上述細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，并成功將pCMV-NogoA質(zhì)粒和NgR1 siRNA導(dǎo)入至相應(yīng)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因過表達(dá)和敲降的目的。

圖3 NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用以NogoA-NgR1依賴性方式被抑制

接下來，作者通過活細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察了NK細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的相互作用，以探究NgR1如何抑制NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷。結(jié)果表明，大多數(shù)對照NK92細(xì)胞與U87MG細(xì)胞只有瞬時相互作用，而NEP1-40處理的NK92細(xì)胞與U87MG細(xì)胞穩(wěn)定接觸，且部分NK92細(xì)胞最終殺死U87MG細(xì)胞（圖4a）。通常情況下，NK細(xì)胞與靶細(xì)胞先產(chǎn)生瞬時相互作用，然后形成穩(wěn)定突觸，再引導(dǎo)裂解細(xì)胞顆粒的極化分泌進(jìn)行靶細(xì)胞裂解（圖4b）。研究發(fā)現(xiàn)，NEP1-40處理顯著減少了瞬時相互作用，增加了接觸時間，從而增強(qiáng)了細(xì)胞毒性（圖4c-e）。這表明，NgR1信號通過干擾穩(wěn)定的突觸形成來降低NK細(xì)胞的殺傷作用。

在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，該團(tuán)隊還通過一系列實(shí)驗(yàn)深入探究了NgR1信號調(diào)節(jié)NK細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸的分子機(jī)制，證明了NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的接觸是由NgR1信號通路介導(dǎo)的F-肌動蛋白動態(tài)變化實(shí)現(xiàn)的，NgR1能促進(jìn)F-肌動蛋白從細(xì)胞間接觸向外聚合，導(dǎo)致NK92細(xì)胞在細(xì)胞顆粒向IS極化之前脫離。最后，他們使用異種移植小鼠模型對NgR1阻斷劑的治療效果進(jìn)行了初步研究，證明了NgR1在免疫細(xì)胞中的表達(dá)可以作為免疫檢查點(diǎn)抑制IS的形成，并認(rèn)為NgR1可能是腫瘤控制中一個新的治療靶點(diǎn)。總之，作者通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計和巨大的工作量證明了NgR1是一種新型的NK細(xì)胞抑制性受體，它通過LIMK-cofilin介導(dǎo)的肌動蛋白動態(tài)變化來抑制穩(wěn)定IS的形成，進(jìn)而調(diào)控NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷力，揭示了NgR1改善NK細(xì)胞功能的一種潛在機(jī)制。

在本研究的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，該團(tuán)隊多次借助NEPA21電轉(zhuǎn)染儀將質(zhì)粒和siRNA成功導(dǎo)入至腫瘤細(xì)胞或NK細(xì)胞中，這顯現(xiàn)出NEPA21在難轉(zhuǎn)染細(xì)胞中具有良好的轉(zhuǎn)染效果，可以為科研人員在NK細(xì)胞的研究中提供強(qiáng)大助力。

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用全新設(shè)計的電轉(zhuǎn)程序，配合專利的電壓衰減設(shè)計，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時，提高細(xì)胞存活率。操作簡單，電轉(zhuǎn)參數(shù)可見可調(diào)，適用性強(qiáng)。特別適用于難轉(zhuǎn)染的原代免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、活體動物、受精卵及宮內(nèi)胚胎等的轉(zhuǎn)染，已應(yīng)用于眾多著名期刊文獻(xiàn)中，是進(jìn)行懸浮/貼壁細(xì)胞、活體和離體組織轉(zhuǎn)染的電轉(zhuǎn)系統(tǒng)主流品牌之一。
 

文獻(xiàn)信息

（1）論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41590-022-01394-w

（2）參考文獻(xiàn)：

Oh, SC., Kim, SE., Jang, IH. et al. NgR1 is an NK cell inhibitory receptor that destabilizes the immunological synapse. Nat Immunol 24, 463–473 (2023).

https://doi.org/10.1038/s41590-022-01394-w

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