母源-合子轉(zhuǎn)化(MZT)是卵母細(xì)胞由母源環(huán)境向合子基因組驅(qū)動(dòng)的表達(dá)程序轉(zhuǎn)變的一個(gè)基本而保守的過程，這一過程將最終分化的卵母細(xì)胞和精子重新編程為全能性狀態(tài)。MZT是由母體mRNA和蛋白質(zhì)啟動(dòng)，隨后逐漸轉(zhuǎn)為合子基因組激活（ZGA），并伴隨著母源RNA和蛋白質(zhì)的清除。胚胎發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵問題是MZT如何被調(diào)節(jié)。然而，盡管母體沉積的快速清除的mRNA和新合成的合子RNA產(chǎn)物在推動(dòng)早期胚胎發(fā)生方面具有重要意義，但RNA控制的各種機(jī)制仍然知之甚少。N6-甲基腺苷(m⁶A)是高等真核生物信使RNA (mRNA)中最常見的內(nèi)部修飾，在細(xì)胞命運(yùn)維持和轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用。但是m⁶A修飾對MZT過程中RNA代謝的潛在調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

2023年4月，中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉真研究組、孫怡迪研究組與上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院單細(xì)胞組學(xué)與疾病研究中心李辰研究組合作在Genome Biology（IF 17.906）期刊發(fā)表了題為“Reading and writing of mRNA m⁶A modification orchestratematernal-to-zygotic transition in mice”的研究論文。該研究利用SLIM-seq技術(shù)繪制出小鼠胚胎母源-合子轉(zhuǎn)換過程中RNA m⁶A修飾動(dòng)態(tài)圖譜，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析和CRISPR/Cas13d介導(dǎo)基因敲低揭示m⁶A的讀寫對于小鼠著床前胚胎發(fā)育的影響。中科新生命為研究提供4D-DIA蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)支持。
 

 研究材料

 技術(shù)路線

步驟1：MZT期間m⁶A標(biāo)記mRNA的動(dòng)態(tài)圖譜分析；

步驟2：m⁶A修飾功能分析：促進(jìn)RNA衰變，亦可維持RNA穩(wěn)定；

步驟3：m⁶A修飾通過維持mRNA的穩(wěn)定性調(diào)控MZT；

步驟4：Ythdc1結(jié)合m⁶A修飾的mRNA并調(diào)控其穩(wěn)定性。

 研究內(nèi)容
 

1. MZT期間m⁶A標(biāo)記mRNA的動(dòng)態(tài)圖譜分析

為了揭示MZT期間m⁶A的動(dòng)態(tài)圖譜，作者對小鼠的MII卵母細(xì)胞、晚期1細(xì)胞(L1C)和晚期2細(xì)胞(L2C)胚胎進(jìn)行SLIM-seq（微量樣本m⁶A測序技術(shù)）分析(圖1a)。SLIM-seq中共鑒定到3396個(gè)m⁶A標(biāo)記的mRNAs和973個(gè)m⁶A標(biāo)記的ncRNAs（圖1b）。與RNA-seq對比分析發(fā)現(xiàn)m⁶A標(biāo)記的mRNA數(shù)量在受精后顯著減少，而在合子基因組激活(ZGA)期間增加，在不同階段，m⁶A水平的變化與m⁶A標(biāo)記mRNA數(shù)量的變化相同，揭示了早期胚胎發(fā)育過程中m⁶A動(dòng)態(tài)的三種主要模式：母體丟失、一致遺傳和新生獲得(圖1c-1e)。綜上所述，小鼠MZT期間m⁶A標(biāo)記的mRNA呈現(xiàn)高度動(dòng)態(tài)變化。

2. m⁶A修飾功能分析：促進(jìn)RNA衰變，亦可維持RNA穩(wěn)定

卵母細(xì)胞的成熟和受精均伴隨RNA的降解，之前的研究表明m⁶A結(jié)合蛋白Ythdf2在母體RNA衰變中發(fā)揮重要作用。m⁶A是否參與了受精后RNA的降解仍未知。SLIM-seq分析發(fā)現(xiàn)982個(gè)m⁶A標(biāo)記的基因在MII卵母細(xì)胞中特異性富集而在受精后丟失,且近半的標(biāo)記基因其mRNA表達(dá)水平下降，表明m⁶A對這些mRNA具有促衰變作用。1243個(gè)基因從L1C到L2C中被m⁶A新標(biāo)記，即在是受精后重新產(chǎn)生，且近半新標(biāo)記的基因的mRNA表達(dá)水平增加。另外發(fā)現(xiàn)609個(gè)m⁶A標(biāo)記基因一致地從MII卵母細(xì)胞遺傳到L2C胚胎，其mRNA水平上亦沒有變化（圖1f-1g）。綜上所述，除了促進(jìn)RNA衰變外，m⁶A修飾還參與維持RNA的穩(wěn)定性。

圖1 小鼠MZT期間m⁶A動(dòng)態(tài)圖譜分析和功能分析

 

3. m⁶A修飾通過維持mRNA的穩(wěn)定性調(diào)控MZT

由于m⁶A修飾的基因是遺傳的，故作者推測這些mRNA是為了促進(jìn)翻譯而維持的，并與哈佛大學(xué)張毅團(tuán)隊(duì)發(fā)表的同時(shí)期LiRibo-seq翻譯圖譜進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示，在609個(gè)m⁶A標(biāo)記基因中，LiRibo-seq數(shù)據(jù)中可檢測到559個(gè)(圖2a)，且其中大多數(shù)基因在L1C和L2C階段翻譯水平升高，表明母系遺傳的m⁶A標(biāo)記mRNA在此階段進(jìn)行了翻譯（圖2b）。隨后作者采用4D-DIA蛋白質(zhì)組學(xué)的方法進(jìn)一步驗(yàn)證，每個(gè)蛋白質(zhì)組樣品僅使用20個(gè)小鼠卵母細(xì)胞或胚胎細(xì)胞，共檢測到5328個(gè)基因編碼的5353種蛋白質(zhì)。其中LiRibo-seq數(shù)據(jù)中可檢測到的559個(gè)基因中有333個(gè)基因在蛋白質(zhì)組學(xué)中亦檢測到了。聚類分析發(fā)現(xiàn)在MZT期間，大多數(shù)基因的表達(dá)水平保持或增加。GO分析結(jié)果顯示，這些基因顯著富集在mRNA和蛋白酶體調(diào)控中(圖2c-2h)。綜上，母系遺傳的m⁶A標(biāo)記的mRNA通過維持穩(wěn)定性用于翻譯，進(jìn)而調(diào)控MZT。

 

4. Ythdc1結(jié)合m⁶A修飾的mRNA并調(diào)控其穩(wěn)定性

mRNA的m⁶A修飾受多方面的調(diào)控：甲基轉(zhuǎn)移酶、脫甲基酶和 m⁶A結(jié)合蛋白，它們在早期胚胎發(fā)育的不同階段發(fā)揮不同的作用。為了探究這些蛋白質(zhì)對mRNA功能的影響，作者采用CRISPR/Cas13d技術(shù)同時(shí)敲低小鼠受精卵中m6A的調(diào)控因子Ythdc1和Ythdf2，發(fā)現(xiàn)可以顯著影響小鼠著床前胚胎發(fā)育（圖2i）。為進(jìn)一步研究Ythdc1對m⁶A標(biāo)記的mRNA的影響，敲低Ythdc1的胚胎進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR等實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Ythdc1可以結(jié)合一些母源攜帶m⁶A的轉(zhuǎn)錄本，并參與其RNA穩(wěn)定性調(diào)控(圖2j-2o）。

圖2 母系遺傳的m⁶A修飾維持mRNA的穩(wěn)定性并與蛋白質(zhì)翻譯有關(guān)

 

 小結(jié)

該研究揭示了小鼠MZT過程中的m⁶A修飾的動(dòng)態(tài)變化，鑒定了少量參與著床前胚胎發(fā)育的m⁶A調(diào)控分子，初步闡明了Ythdc1可能參與母源繼承m⁶A轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性調(diào)控，體現(xiàn)了多組學(xué)分析在胚胎發(fā)育研究中的重要性。

 

閱讀原文

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-023-02918-9

參考文獻(xiàn)

Yin et al., Cell Stem Cell, 2021

Zhang et al., Sci Adv. 2022

Gu et al., bioRxiv, 2023

Kushawah et al., Dev Cell, 2020