單細胞及空間多組學揭示APOE4在衰老、神經(jīng)炎癥和阿爾茲海默癥的機制
代謝功能障礙和慢性神經(jīng)炎癥是包括多種神經(jīng)退行性疾病的共同特征。其中，晚發(fā)性 阿爾茲海默癥（AD）最強的遺傳風險因素載脂蛋白 E（APOE） 的E4等位基因與代謝功能障礙和增強的促炎癥反應有關。淀粉樣蛋白斑塊觸發(fā)附近小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄變化，導致向病理特征轉(zhuǎn)變。這些重要的研究共同強調(diào)了APOE、衰老和大腦區(qū)域在代謝和免疫變化中的淀粉樣蛋白依賴性和獨立性作用。2023年3月，來自University of Kentucky研究團隊在 Cell Reports （IF 10.99）上發(fā)表題為“APOE modulates microglial immunometabolism in response to age, amyloid pathology, and inflammatory challenge”的研究文章。該研究結合單細胞和空間多組學技術，系統(tǒng)地描述APOE4在大腦對衰老、外周炎癥挑戰(zhàn)和淀粉樣蛋白病理學的反應中的作用（有氧糖酵解增加和脂質(zhì)代謝途徑的表達改變），為后續(xù)的研究提供更加堅實的理論基礎。
樣本選擇：APOE3（野生型）、APOE4（突變型）和5XFAD（雜交模型）小鼠的大腦組織
取樣時間/分組：不同時間點（3、12 和 24 個月齡）、脂多糖處理 (LPS)和淀粉樣蛋白過表達的小鼠（n=3~5）
技術路線
步驟1：單細胞多組學揭示APOE4對阿爾茲海默癥的影響；
步驟2：單細胞多組學聯(lián)合揭示LPS刺激下的小膠質(zhì)細胞代謝特征；
步驟3：空間轉(zhuǎn)錄組學揭示APOE4 加劇小膠質(zhì)細胞活化和脂質(zhì)代謝功能激活;
步驟4：空間代謝組證實APOE、衰老和淀粉樣蛋白對多種脂質(zhì)代謝途徑表達的顯著影響。
研究結果
1. 單細胞多組學揭示APOE4 驅(qū)動神經(jīng)膠質(zhì)轉(zhuǎn)錄組的免疫代謝變化
通過常規(guī)轉(zhuǎn)錄組檢測APOE對AD小鼠的整個生命周期的影響，在AOPE4和AOPE3大腦之間發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個差異表達基因（DEG），包括Serpina3n等。接下來，進一步對DEG進行了通路分析，發(fā)現(xiàn)TOP 十富集的通路中有9個屬于代謝或免疫相關的途徑。為了確定細胞特異性對這些基因表達變化的貢獻，對大腦組織進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組檢測，結果共鑒定出了13種細胞類型。而通過對細胞群的DEG分析發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、室管膜細胞和小膠質(zhì)細胞是受APOE影響最大的細胞類型。然后，對所有細胞的DEG進行通路分析再次突出了代謝的重要作用，尤其是氧化磷酸化和糖酵解相關通路。這些結果表明APOE4主要驅(qū)動的是神經(jīng)膠質(zhì)細胞的代謝和免疫反應。
圖1 APOE4驅(qū)動神經(jīng)膠質(zhì)轉(zhuǎn)錄組的免疫代謝變化
2. 單細胞多組學揭示DAM樣小膠質(zhì)細胞在AOPE4老年腦中增加
淀粉樣斑塊觸發(fā)附近小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄變化，并且誘導其向病理特征的轉(zhuǎn)變，這些發(fā)生病理特征轉(zhuǎn)變的小膠質(zhì)細胞被稱為疾病相關小膠質(zhì)細胞(DAMs)。通過對單細胞數(shù)據(jù)的進一步分析，發(fā)現(xiàn)在高齡和AOPE4小鼠腦中都被上調(diào)的基因大量富集了DAM。此外，AOPE4小鼠中小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄組中的特異性變化與之前研究報道的結果相似。觀察到許多AD相關基因的表達模式相反，與E3相比，年輕的AOPE4小膠質(zhì)細胞表達更高。通過對所有星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的亞群再聚類分析，發(fā)現(xiàn)一個小膠質(zhì)細胞的Mi_6亞群中APOE上調(diào)，其定義Mi_6亞群特征的marker基因幾乎完全是與DAM特征相關的基因，包括代謝基因Lpl、Ch25h、Fabp5和APOE本身。以及Mi_6小膠質(zhì)細胞的通路分析顯著表現(xiàn)在膽固醇代謝和糖酵解代謝相關的信號通路。進一步的SCENIC分析發(fā)現(xiàn)了Mi_6亞群中16個特異性的轉(zhuǎn)錄因子。有趣的是，這些轉(zhuǎn)錄因子中有幾個先前的報道與AD有關。特別是HIF1α，在Mi_6中大幅上調(diào)，并與細胞的DAM評分呈正相關�？傊@些數(shù)據(jù)表明，即使沒有明顯的AD病理學，衰老和AOPE4也足以驅(qū)動小膠質(zhì)細胞發(fā)生變化。
淀粉樣斑塊觸發(fā)附近小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄變化，并且誘導其向病理特征的轉(zhuǎn)變，這些發(fā)生病理特征轉(zhuǎn)變的小膠質(zhì)細胞被稱為疾病相關小膠質(zhì)細胞(DAMs)。通過對單細胞數(shù)據(jù)的進一步分析，發(fā)現(xiàn)在高齡和AOPE4小鼠腦中都被上調(diào)的基因大量富集了DAM。此外，AOPE4小鼠中小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄組中的特異性變化與之前研究報道的結果相似。觀察到許多AD相關基因的表達模式相反，與E3相比，年輕的AOPE4小膠質(zhì)細胞表達更高。通過對所有星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的亞群再聚類分析，發(fā)現(xiàn)一個小膠質(zhì)細胞的Mi_6亞群中APOE上調(diào)，其定義Mi_6亞群特征的marker基因幾乎完全是與DAM特征相關的基因，包括代謝基因Lpl、Ch25h、Fabp5和APOE本身。以及Mi_6小膠質(zhì)細胞的通路分析顯著表現(xiàn)在膽固醇代謝和糖酵解代謝相關的信號通路。進一步的SCENIC分析發(fā)現(xiàn)了Mi_6亞群中16個特異性的轉(zhuǎn)錄因子。有趣的是，這些轉(zhuǎn)錄因子中有幾個先前的報道與AD有關。特別是HIF1α，在Mi_6中大幅上調(diào)，并與細胞的DAM評分呈正相關�？傊@些數(shù)據(jù)表明，即使沒有明顯的AD病理學，衰老和AOPE4也足以驅(qū)動小膠質(zhì)細胞發(fā)生變化。
圖2 衰老和 APOE4與DAM樣小膠質(zhì)細胞的增加有關
3. 單細胞多組學探究炎癥促進APOE4小膠質(zhì)細胞的代謝功能激活
鑒于AOPE4小膠質(zhì)細胞表現(xiàn)出的代謝和DAM樣特征，接下來研究AOPE4的小膠質(zhì)細胞是否會對炎癥挑戰(zhàn)做出不同的反應。通過外周注射LPS和生理鹽水，24 小時后，作者從AOPE3和AOPE4小鼠中收取大腦組織，分選后對小膠質(zhì)細胞群進行單細胞轉(zhuǎn)錄組檢測。在單細胞數(shù)據(jù)分析的結果中顯示，LPS處理組中，小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生了幾個不同的亞群，包括兩個富含AOPE3 LPS大腦的亞群（5 和 7）和兩個幾乎完全存在于AOPE4 LPS大腦中的亞群（8 和11）。其中，富含AOPE4 LPS的亞群表達的DEG富集分析結果顯示與線粒體功能、有氧呼吸和能量產(chǎn)生功能相關。并且，這些細胞亞群還顯示出與氧化磷酸化和糖酵解途徑相關的基因高表達。以上的數(shù)據(jù)表明，AOPE4的小膠質(zhì)細胞中炎癥刺激下產(chǎn)生強烈的代謝應激反應。
圖3 APOE4小膠質(zhì)細胞在應對炎癥挑戰(zhàn)時代謝不同
接下來，作者使用靶向代謝組學方法，確定了五種在 AOPE4小膠質(zhì)細胞中顯著上調(diào)的代謝物和一種顯著下調(diào)的代謝物。為了確定這些代謝物的差異是否是 AOPE4小膠質(zhì)細胞代謝動態(tài)變化的一部分，接下來使用穩(wěn)定同位素分辨代謝組學技術。在存在13C葡萄糖的情況下，用 IFNg和TNF-α的組合刺激AOPE3和AOPE4小膠質(zhì)細胞，并測量下游代謝物中13C 的摻入。結果表明，在APOE4和促炎環(huán)境中，標記的(m+3) 13C乳酸顯著增加，表明通過有氧糖酵解途徑增強。為了進一步從功能上評估APOE對小膠質(zhì)細胞代謝的影響，使用Seahorse平臺來測量糖酵解、線粒體呼吸等多個途徑對 ATP產(chǎn)生的相對貢獻。AOPE4小膠質(zhì)細胞主要是通過增加糖酵解生成ATP來響應促炎刺激。另外，HIF1α TF復合物易位至細胞核并激活許多對增加糖酵解很重要的基因，HIF1α的這種表現(xiàn)與AOPE4模型小膠質(zhì)細胞的表型一致。接下來，作者對這些分析結果數(shù)據(jù)通過RT-PCR進行了驗證。綜上所述，這些數(shù)據(jù)共同突出了功能性代謝重編程，AOPE4小膠質(zhì)細胞表現(xiàn)的是經(jīng)典活化的巨噬細胞的表型，具有促糖酵解和抗氧化的作用。
圖4 AOPE4 小膠質(zhì)細胞增加了有氧糖酵解和更高的 Hif1a 表達
4. 空間轉(zhuǎn)錄組學研究顯示APOE4加劇小膠質(zhì)細胞的活化和脂質(zhì)代謝
接下來，利用10x visium空間轉(zhuǎn)錄組技術研究了AOPE3、AOPE4以及與5XFAD雜交的小鼠在年輕和年老時冠狀腦切片的表達情況。對這些數(shù)據(jù)進行分析共鑒定出了18個clusters，并且發(fā)現(xiàn)只有一個cluster（cluster11）特異性存在于AOPE4/5XFAD雜交小鼠的大腦皮質(zhì)區(qū)。通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，這一特殊的cluster顯著富集脂質(zhì)代謝、突觸修剪、神經(jīng)元死亡以及小膠質(zhì)細胞激活相關的基因。將這些數(shù)據(jù)與單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，結果表明，這一特征僅在小膠質(zhì)細胞中表達，尤其是Mi_6亞群的表達尤為顯著。為了確定這種獨特的AOPE4/5XFAD轉(zhuǎn)錄譜是否在空間上與AD病理相關，我們對空間轉(zhuǎn)錄組相鄰10μm的位置取了切片用于染色，充分驗證了空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的結果。然后，作者基WGCNA分析突出顯示了斑塊強度與包含與離子通道和突觸傳遞相關的基因的兩個基因網(wǎng)絡呈負相關。然后將結果映射到單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)上，作者發(fā)現(xiàn)了一個被稱為 “小膠質(zhì)細胞激活模塊”的洋紅色調(diào)控網(wǎng)絡被映射到小膠質(zhì)細胞上，而紅色的“脂質(zhì)、少突膠質(zhì)細胞反應性”模塊主要映射到少突膠質(zhì)細胞。有趣的是，紅色和洋紅色模塊在APOE4/5XFAD小鼠進行的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中確定的少突膠質(zhì)細胞基因（OLIG）和plaque-induced gene (PIG) 網(wǎng)絡實質(zhì)上重疊。并且PIG 評分在年輕大腦中最低，隨著年齡的增長略有增加，在APOE4/5XFAD大腦中最高，而OLIG評分遵循相反的趨勢�？傊�，這些數(shù)據(jù)突出了APOE4小膠質(zhì)細胞活化增強以及脂蛋白和脂質(zhì)代謝的改變。
圖5 APOE4加劇小膠質(zhì)細胞活化和脂質(zhì)代謝的改變
5. 空間代謝組學證實APOE、衰老和淀粉樣蛋白對多種脂質(zhì)代謝途徑表達的顯著影響
在上述的腦組織空間轉(zhuǎn)錄組研究中，作者注意到 APOE、衰老及其相互作用對多種脂質(zhì)代謝途徑有顯著影響。為了驗證涉及脂質(zhì)失調(diào)的特征，作者通過空間代謝組學技術（MALDI-MSI）來對目標脂質(zhì)種類進行空間分辨的定性和定量檢測，并且只在APOE4/5XFAD小鼠腦中發(fā)現(xiàn)與疾病相關的病理區(qū)域。與其他組相比，APOE4/5XFAD腦組織中多種脂質(zhì)種類的含量發(fā)生了變化，包括多種磷脂酰膽堿（PC）。APOE4/5XFAD大腦中磷脂酰膽堿增加最多的PC(16:0/18:2)在皮質(zhì)、海馬體和丘腦中顯示出巨大變化，但在梨狀區(qū)、皮質(zhì)底板和下丘腦中沒有差異。綜上所述，這些結果表明，APOE4/5XFAD腦脂質(zhì)代謝失調(diào)的轉(zhuǎn)錄特征通過多種脂質(zhì)(特別是PC)的改變得到了驗證。
圖6 多種脂質(zhì)種類的區(qū)域特異性變化
小編小結
在這篇研究中，作者著手時下熱點技術，采用單細胞和空間多組學方法系統(tǒng)地研究 APOE基因型對衰老、炎癥挑戰(zhàn)和淀粉樣蛋白反應的影響。首先，應用單細胞多組學技術揭示了小膠質(zhì)細胞(Mi_6)亞群在APOE4和衰老的AD模型組中的重要作用，詳細的描述了APOE4小膠質(zhì)細胞通過糖酵解等調(diào)控途徑促進炎癥，從而形成有利于慢性神經(jīng)炎癥的情況。其次，作者基于空間轉(zhuǎn)錄組學技術揭示了APOE4腦中看到的PIGhigh/OLIGlow可能導致補體激活，突觸修剪異常以及軸突髓鞘形成失衡，從而進入惡性循環(huán)，傳播神經(jīng)炎癥和脂質(zhì)循環(huán)受損。最后，作者利用空間代謝組學技術還發(fā)現(xiàn)了在APOE4中存在一個與脂質(zhì)代謝相關的特征區(qū)域。總的來說，通過單細胞和空間多組學技術揭示了APOE4通過以代謝途徑為中心使易感腦區(qū)更易發(fā)生神經(jīng)變性的調(diào)控機制，并提出了結合代謝和炎癥的治療方法可能在治療和預防AD方面具有極大的應用前景。
中科優(yōu)品推薦
【中科新生命】重點布局時空多組學平臺，先后建立了基于10x Genomics Chromium X的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序平臺和visium空間轉(zhuǎn)錄組平臺。以及基于Bruker MALDI 2 Tims-tof flex空間代謝組平臺開發(fā)的一站式高端版的空間代謝組學分析解決方案，通過增加分子分離維度和對“后電離”技術的創(chuàng)新應用，實現(xiàn)對代謝物進行空間分布分析的同時完成高深度的定性定量。中科新生命作為國內(nèi)首家引入MALDI 2Tims-tof flex平臺的服務商， 能夠給廣大科研工作者提供相比傳統(tǒng)空間代謝組更多維、更靈敏的代謝檢測服務。
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