香蘭素（4-羥基-3-甲氧基苯甲醛）（圖 1）是天然香草的主要成分，是世界范圍內(nèi)使用最廣泛和最重要的調(diào)味材料之一。
香蘭素可以從熱帶香草蘭(主要是 Vanilla planifolia Andrews) ¹的豆子或豆莢中提取、重組生產(chǎn)或合成。食品配方中使用的純香蘭素的來(lái)源可以通過(guò)其同位素特征²來(lái)區(qū)分。該方法可能需要先進(jìn)行初步純化。
在本研究中，使用香草的乙醇粗提物來(lái)對(duì)比VERITY® PLC 2050 系統(tǒng)與不同類(lèi)型色譜柱配合使用的能力。在 HPLC 制備柱和 CPC PRO 上進(jìn)行香蘭素（Vanillin）的制備純化。對(duì)比了兩種技術(shù)所獲取最終的香蘭素純度、溶劑消耗和進(jìn)樣量。

 

離心分配色譜(CPC)應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)

• 可從 6.3 g 粗提物獲得 500 mg 的純香蘭素，并進(jìn)一步同位素分析確認(rèn)其特性。

• 制備型高效液相色譜法與離心分離色譜法在香蘭素純化方面的比較。

 

解決的問(wèn)題

• 一套制備型液相系統(tǒng) (PLC 2050) 可以同時(shí)適應(yīng)制備高效液相色譜法和離心分離色譜法。
• 與制備高效液相色譜相比，離心分離色譜(CPC 250 PRO) 是復(fù)雜提取物處理的更佳選擇。
• 大幅度減少溶劑消耗，降低成本和對(duì)環(huán)境的影響

 

材料和方法

系統(tǒng)

Gilson VERITY CPC 250 Pro 離心分配色譜儀(圖 2)，或者M(jìn)erck公司的制備HPLC 色譜柱Hibar 250 X 25, C18, 5μm (圖 3) 連接到 Gilson PLC 2050 系統(tǒng), 該系統(tǒng)配有一臺(tái) 50 mL/min 的四元梯度泵，一臺(tái)紫外檢測(cè)器, 一臺(tái)餾分收集器及配套的 Gilson Glider 軟件。

HPLC分析是在LaChrom Elite HPLC (VWR)系統(tǒng)上進(jìn)行的，這套HPLC系統(tǒng)配有波長(zhǎng)范圍200-800nm的二極管陣列檢測(cè)器 (PDA)。

 

樣品

粗提物首先進(jìn)行HPLC分析 (表 1). 香蘭素在rt = 9.9分鐘出峰，280納米處峰值面積為63.7%, (圖 4)。通過(guò)外標(biāo)對(duì)照品校正，粗提物種中香蘭素的含量約為9% (w/w) 。提取物中大部分的分子沒(méi)有被紫外檢測(cè)到。

制備 28 g/L 的香蘭素提取物溶液用于離心分離色譜進(jìn)樣，同時(shí)制備0.08g/L的低濃度樣品用于制備HPLC，以避免進(jìn)樣壓力過(guò)高。

 

方法

制備高效液相色譜與離心分配色譜所運(yùn)行的方法分別詳見(jiàn)表2和表3。當(dāng)使用制備高效液相色譜時(shí)，進(jìn)樣90 mg的粗油，以20mL/min的流速等度洗脫。當(dāng)使用離心分離色譜時(shí)，進(jìn)樣6.3 g的粗油，以30mL/min的升相模式洗脫。

 

結(jié)果和討論

最終得到的制備色譜圖如圖 5 和圖 6所示。兩個(gè)色譜圖中的藍(lán)色區(qū)域代表收集的香蘭素餾分。這些餾分進(jìn)一步使用HPLC進(jìn)行分析，在280nm下的檢測(cè)結(jié)果如圖7和圖8所示。

 

兩種技術(shù)都能獲得純度大于 99% 的香蘭素（表 4）。 此外，使用 CPC 的回收率大于 91.8%（表 4）。 這表明 CPC 能夠避免由于潛在的不可逆吸附而導(dǎo)致的樣品損失。 在制備型 HPLC 中洗脫香蘭素需要 500 毫升溶劑（圖 5），而在 CPC 中洗脫香蘭素僅需使用 360 毫升溶劑（表 4）。由此可以得出，每進(jìn)樣1 g的原料，制備型 HPLC 需要使用5.3升的溶劑，而 CPC只需要使用 0.1 升的溶劑。

本研究中由于制備型 HPLC的進(jìn)樣量低，無(wú)法得到回收的香蘭素的質(zhì)量和產(chǎn)率。

 

結(jié)論

PLC 2050 能夠高效便捷地與 CPC 和 prep HPLC 色譜柱搭配使用，用來(lái)進(jìn)行純化工作。在本文中，通過(guò)對(duì)比CPC與HPLC制備柱，展現(xiàn)了CPC的優(yōu)勢(shì)（表 4）。與 prepHPLC相比，CPC溶劑消耗量更低且無(wú)需固定相（如二氧化硅），進(jìn)樣量更大，而純化效率近似。 這些基于實(shí)驗(yàn)室級(jí)儀器得到的純度，產(chǎn)量，產(chǎn)率等數(shù)據(jù)，可以放大并應(yīng)用到工業(yè)級(jí)CPC （如Gilson VERITY 工業(yè)級(jí)CPC ）解決方案。

 

參考文獻(xiàn)：
1.Vanillin; Walton N.J. and Al; Phytochemistry, 63, (2003), 505-515
2.Zietlow et. al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50(22):6271-5

 

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