韓國浦項科技大學材料科學與工程系Sungjune Jung教授團隊通過使用MicroFab Jetlab II噴墨打印系統(tǒng)使生物墨水能夠在皮升水平上提供均勻的細胞分布，使得真皮上表皮角質(zhì)形成細胞分布的更準確、更均勻。壓電噴墨打印技術(shù)改進了表皮層的構(gòu)建步驟，可以為進一步的研究提供更多種類的皮膚模型。

介紹

皮膚是我們身體最大的部分，代表性特征是其結(jié)構(gòu)由多層組成。最外層的薄層表皮形成了自己的多個亞層，從高度組織化的表皮角質(zhì)形成細胞到抵御入侵者（如生物病原體）的物理屏障，表皮具有保護作用，而真皮主要由細胞外基質(zhì)（ECM）和真皮成纖維細胞組成，發(fā)揮緩沖、傳感、分泌和調(diào)節(jié)等剩余功能。人類皮膚等效物在質(zhì)量、再現(xiàn)性和生產(chǎn)方法方面存在的問題是生物學、醫(yī)學、化妝品和倫理學等許多領(lǐng)域的挑戰(zhàn)性問題之一，為了解決這個問題，浦項科技大學材料科學與工程系Sungjune Jung教授團隊通過結(jié)合兩種打印技術(shù)來制造具有層狀結(jié)構(gòu)的皮膚等效物。

活細胞和生物材料的直接打印為3D組織工程和再生醫(yī)學提供了一種新的解決方案。如圖1所示，利用3D氣動微擠壓打印機將含有人真皮成纖維細胞（HDFn）的膠原蛋白打印在3.0μm孔的膜插入物上。將打印好的真皮轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，使膠原質(zhì)凝固，培養(yǎng)2周。通過使用MicroFab，Jetlab II噴墨打印人表皮角質(zhì)形成細胞（HEKn）均勻分布在真皮上。經(jīng)過角質(zhì)形成細胞穩(wěn)定期1天后，進行氣液界面培養(yǎng)，誘導表皮層分化2周。

▲ 圖1 微擠出-噴墨混合打印制作3D皮膚模型。
 

為了測定真皮的產(chǎn)生，對比實驗測試了3種不同的人類皮膚成纖維細胞：HDFn和Hs68來自新生兒包皮，Detroit 551來自女性胎兒皮膚。與沒有細胞的真皮層相比（圖2B），HDFn細胞直到2周才觀察到收縮（圖2A），Hs68細胞LLI培養(yǎng)7天后觀察到真皮層邊緣出現(xiàn)部分收縮（圖2C），Detroit 551細胞培養(yǎng)4天后觀察到嚴重的收縮（圖2D）。綜合上述結(jié)果，本研究中后續(xù)使用HDFn細胞。

▲ 圖2 根據(jù)不同細胞類型和細胞數(shù)量對真皮生物墨水的比較。

為了保證噴墨打印的穩(wěn)定性，研究了細胞濃度對噴射行為的影響。HEKn細胞在生物墨水中的濃度從6.0×106 cells/mL到2.0×107 cells/mL不等。如圖3A所示，在濃度為6.0×106 cells/mL和1.2×107 cells/mL時，細胞噴射特性穩(wěn)定，無噴嘴堵塞，然而，在濃度為2.0×107 cells/mL的表皮生物墨水中，無法實現(xiàn)穩(wěn)定和連續(xù)的液滴形成。為了確認噴墨過程中表皮層液滴數(shù)量合適，計算了實際打印的細胞數(shù)量，如圖B-C所示，在玻璃基板上打印200個連續(xù)的點，在濃度為1.2×107 cells/mL時，單個液滴平均含有6.6個細胞，而在濃度為6.0×106 cells/mL時，僅含有2.0個細胞�？紤]到后期打印時的不適條件暴露，故后期選擇液滴中細胞數(shù)量更多的1.2×107 cells/mL進行實驗。

▲ 圖3 壓電噴墨的液滴觀察和角質(zhì)形成細胞打印密度控制。

此外，研究了微擠出和噴墨印刷對皮膚細胞活力的影響，如圖4所示，測量了膠原中HDFn細胞的活力，打印組（91.75%）和移液組（95.75%）HDFn的生存力差異可以忽略不計，打印后5周真皮成纖維細胞的存活率超過90%，在打印和培養(yǎng)過程中，沒有發(fā)現(xiàn)任何一種皮膚細胞類型的嚴重細胞損傷。

▲ 圖4 打印和長期培養(yǎng)的細胞活力測試。

為了測試角質(zhì)形成細胞在真皮層的分布，在打印和手動移液后立即對沉積的角質(zhì)形成細胞層進行組織學染色，獲得橫切面圖像。在噴墨打印的皮膚中，觀察到真皮腫塊上均勻分布的薄層（圖5A）；然而，在手工生成的皮膚中反復發(fā)現(xiàn)細胞聚集的不均勻?qū)樱▓D5B）。在角化細胞沉積后，發(fā)現(xiàn)使用噴墨打印的角化細胞擴散區(qū)域保持在最初打印區(qū)域附近，而移液生成的區(qū)域是最初移液區(qū)域的兩倍多（圖5C）ALI培養(yǎng)后，觀察到噴墨打印的皮膚上層相對均勻增厚（圖5E）；然而在移液生成的皮膚中，產(chǎn)生了不均勻的增厚層（圖5F）。這種差異與表皮兩層角質(zhì)形成細胞分布的差異在很大程度上是一致的（圖5G和H）。

▲ 圖5 噴墨打印及移液生成的表皮層對比。

ALI培養(yǎng)期結(jié)束后，成功獲得了多層皮膚，皮膚模型顯示了豐富的ECM層，在真皮層的頂部觀察到廣泛的角質(zhì)形成細胞形成上表皮層，組織學圖像顯示出與真實皮膚的層狀結(jié)構(gòu)相似的輪廓，如圖6A所示。由于人體皮膚的每一層都表達了體內(nèi)的特定蛋白質(zhì)，使用特定抗體的免疫熒光染色可以揭示皮膚組織中功能標記物的表達。圖6B-E的結(jié)果表明，打印皮膚由真皮層、基底膜和中間狀態(tài)的分層表皮層組成。
 

▲ 圖6 打印的3D皮膚等效物的組織學染色和免疫化學分析。

結(jié)論
通過將氣動微擠出和壓電噴墨打印結(jié)合，產(chǎn)生了一種具有多層的皮膚結(jié)構(gòu)，包括富含膠原蛋白的下層（真皮）、中間層（真皮和表皮之間的基底膜）和薄分化的上層（表皮）。表皮層的均勻分布是皮膚組織生成的關(guān)鍵考慮因素之一，通過使用MicroFab Jetlab II噴墨打印系統(tǒng)使生物墨水能夠在皮升水平上提供均勻的細胞分布，使得真皮上表皮角質(zhì)形成細胞分布的更準確、更均勻。壓電噴墨打印技術(shù)改進了表皮層的構(gòu)建步驟，可以為進一步的研究提供更多種類的皮膚模型。

參考文獻：
[1] Hrl A ,  Ju A ,  Sk B , et al. 3D microextrusion-inkjet hybrid printing of structured human skin equivalents - ScienceDirect[J]. Bioprinting, 22.