最近幾年，基于對(duì)綠藻和藍(lán)細(xì)菌的一些測(cè)量結(jié)果，打破了我們長期認(rèn)為的光合生物體內(nèi)可變熒光完全來自光系統(tǒng)II的認(rèn)知范式。通過比較光誘導(dǎo)的Fv＞700 nm和Fv＜710 nm的變化可以用來鑒定Fv(I)。強(qiáng)光誘導(dǎo)的Fv(I)在Fv＞700 nm時(shí)比在Fv＜710 nm時(shí)約大1.5倍。近期Ulrich Schreiber教授發(fā)表在Photosynthesis Research上的最新研究成果以模式綠藻小球藻(Chlorella vulgaris)為研究對(duì)象，通過比較遠(yuǎn)紅光(720 nm，大部分被PSI吸收)和可見光(540 nm，被PSI和PSII吸收)激發(fā)的光誘導(dǎo)長波熒光(＞765 nm)變化，進(jìn)一步擴(kuò)展了該方面的工作。該研究測(cè)量了由540 nm飽和光引起的可變熒光(Fv)多相上升曲線，將初始O-I₁上升相歸一化后，假定反映Fv(II)，結(jié)果顯示出720 nm激發(fā)(720 ex)的 I₂-P瞬態(tài)比540 nm激發(fā)(540 ex)的高2倍的。分析Fo(I)對(duì)Fo(720 ex)和Fo(540 ex)的貢獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)o(I)720 ex比Fo(I)540 ex高2倍，這支持了整個(gè)I₂-P瞬變是由Fv(I)引起的觀點(diǎn)。F(I)/F(II)的激發(fā)比從 680 nm 到 720 nm 的兩倍增加遠(yuǎn)小于作用光譜已知的PSI/PSII 的八到十倍增加。有人認(rèn)為，測(cè)得的F＞765 nm并不代表PSI的大部分葉綠素，而是反映了一小部分具有吸收遠(yuǎn)紅光特性的葉綠素形式(“red Chls”)。另外，基于相同的方法，即比較用720 ex和540 ex測(cè)量的多相上升曲線，F(xiàn)v(I)也被證實(shí)普遍存在于其他各種光合生物中，如藍(lán)細(xì)菌、苔蘚、蕨類植物、高等植物葉片。
  上述研究結(jié)果是由德國伍茲堡大學(xué)教授Ulrich Schreiber使用多激發(fā)波長調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMulti-Color-PAM和雙通道葉綠素?zé)晒鈨xDUAL-PAM-100組合的測(cè)量系統(tǒng)做出的。文章于2023年1月4日發(fā)表在光合作用專業(yè)期刊Photosynthesis Research上，標(biāo)題為“Light-induced changes of far-red excited chlorophyll fluorescence: further evidence for variable fluorescence of photosystem I in vivo”。在本研究中Multi-Color-PAM充分發(fā)揮了它出色靈敏度與卓越時(shí)間分辨率(10 µs)相結(jié)合的特點(diǎn)，同時(shí)它還具有多個(gè)波長的激發(fā)光，非常適合于研究光系統(tǒng)捕光天線尺寸，反應(yīng)中心關(guān)閉和開放，以及類胡蘿卜素自由基參與進(jìn)行的快速高光強(qiáng)淬滅(HIQ)。
 

 

2021年初Ulrich Schreiber教授曾在Photosynthesis Research上發(fā)表過一篇題為Evidence for variable chlorophyll fluorescence of photosystem I in vivo的文章。研究了綠色單細(xì)胞藻類小球藻、藍(lán)藻聚球藻和淡綠色常春藤葉片，呈現(xiàn)的結(jié)果為體內(nèi)存在可變PS I熒光Fv(I)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。這次通過測(cè)量遠(yuǎn)紅光激發(fā)誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒獾淖兓療o疑為活體內(nèi)存在光系統(tǒng)I可變熒光進(jìn)一步提供了新的證據(jù)。(往期推文：科學(xué)家發(fā)現(xiàn)活體中光系統(tǒng)I存在可變?nèi)~綠素?zé)晒獾淖C據(jù))
 

 

使用遠(yuǎn)紅光(FR，優(yōu)選720 nm)或可見光(優(yōu)選540 nm)脈沖調(diào)制激發(fā)檢測(cè)單元比較測(cè)量光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量變化的實(shí)驗(yàn)裝置框架圖。光學(xué)單元的幾何形狀針對(duì)兩種類型的測(cè)量光(ML)以及540 nm光化光(AL)和多周轉(zhuǎn)閃光 (MT)的均勻照明進(jìn)行了優(yōu)化。脈沖調(diào)制熒光的相對(duì)產(chǎn)率是用由PamWin-3軟件控制的Multi-Color-PAM熒光儀測(cè)量的。定制的540 nm LED陣列由DUAL-PAM-100的控制單元(DUAL-C)供電，并通過從MC-PAM獲得的預(yù)編程觸發(fā)信號(hào)進(jìn)行控制。
 

 

使用720 nm(紅線，720ex)和540 nm(藍(lán)線，540ex)脈沖調(diào)制測(cè)量光測(cè)量暗適應(yīng)的小球藻懸浮液得到的多相熒光上升曲線。熒光從I₁-P的相變，720ex大于540ex。在MT誘導(dǎo)過程中，兩個(gè)信號(hào)之間的差異在2 ms內(nèi)保持在675 mV，然后在上升到P點(diǎn)期間增加到755 mV。由于720ex的PSI/PSII激發(fā)比毋庸置疑的高于540ex，這意味著上升P點(diǎn)的部分熒光必須來自PSI，因此反映了Fv(I)。
 

 

使用720 nm脈沖調(diào)制激發(fā)測(cè)量的多相熒光上升曲線，將Fo反卷積為Fo(I)和Fo(II)的貢獻(xiàn)。Fo(540ex)由35%Fo(I)和65%Fo(II)組成，F(xiàn)o(720ex)由52%Fo(I)和48%Fo(II)組成。540ex的Fo(I)/Fo(II) = 35/65 = 0.539，而720ex的為52/48 = 1.083。因此，720ex的Fo(I)/Fo(II)比率恰好比540ex大2倍。因此，F(xiàn)v(I)/Fv(II)的比率也應(yīng)比720ex比540ex高2倍。
 

暗適應(yīng)后(PQ庫部分還原)小球藻全部Fv(720ex)多相上升動(dòng)力學(xué)的Fv(I)和Fv(II)組分的反卷積。
 

在弱FR背景光(PQ庫預(yù)氧化)存在下，全部Fv(720ex)動(dòng)力學(xué)的Fv(I)和Fv(II)分量的反卷積。
 

 

小球藻540ex和680ex(圖a)，700ex(圖b)，720ex(圖c)的多相上升動(dòng)力學(xué)。680 nm以上的激發(fā)波長下顯示出“額外的Fv(I)”。
 

 

小球藻中“額外Fv(I)”的信息源自使用540ex 和紅光-光紅光光譜范圍內(nèi)的各種激發(fā)波長對(duì)多相上升動(dòng)力學(xué)的比較測(cè)量。a: “額外Fv(I)”的動(dòng)力學(xué)。b “額外Fv(I)”的振幅與紅光-光紅光激發(fā)波長的函數(shù)。“額外的Fv(I)”被縮放為O-I₁振幅的分?jǐn)?shù)。
 

 

使用720ex(紅線)和540ex(綠線)測(cè)量的 3 種不同強(qiáng)度的540 nm光化照明開始時(shí)的暗-光熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線探究Fv(I)對(duì)光化強(qiáng)度的依賴性。
 

 

0.1 μM DCMU(a)和1 μM DCMU(b)對(duì)用720ex和540ex測(cè)量的多相上升動(dòng)力學(xué)曲線的影響。
 

不同光合生物各自720ex和540ex 測(cè)量的Fv值之間的差異。這些結(jié)果只是為了證明光合生物中“額外Fv(I)”現(xiàn)象的普遍性。

Fv(I)對(duì)解釋多相上升動(dòng)力學(xué)的意義

截至目前，強(qiáng)光化光引起熒光產(chǎn)率的多相上升動(dòng)力學(xué)幾乎完全根據(jù)Fv(II)來解釋。雖然人們普遍認(rèn)為“光化學(xué)”O-I₁(或O-J)相反映了PSII反應(yīng)中心關(guān)閉時(shí)的Fv(II)，但“熱”I₁-I₂-P(或J-I-P)相對(duì)此則給出了完全不同的解釋。隨著研究人員的新證據(jù)證明I₂-P相反映了小球藻中的Fv(I)，我們必須重新考慮以前對(duì)多相上升動(dòng)力學(xué)這部分的解釋。至于前面的I₁-I₂階段，最新的文章以及Schreiber和Klughammer 2021的文章中提供的數(shù)據(jù)清楚地表明它反映了Fv(II)，這就提出了I₁相對(duì)于I₂ 的淬火性質(zhì)問題。文獻(xiàn)中討論了涉及PSⅡ受體和供體側(cè)、氧化的PQ以及PSII 反應(yīng)中心水平的“構(gòu)象”變化的許多機(jī)制。一個(gè)關(guān)鍵觀察結(jié)果是DCMU消除了這種猝滅。支持Schansker 等人的早期結(jié)論�；�于 PSII 構(gòu)象變化的淬火機(jī)制受到Magyar 等人的青睞。他們基于的結(jié)果是在DCMU存在的情況下對(duì)閃光引起的熒光上升的測(cè)量。在這些研究中，在飽和的1.5 µs閃光后達(dá)到中間熒光產(chǎn)率 F1，并且只有大量這樣的閃光才能達(dá)到最大熒光產(chǎn)率 Fm。從 F1 到 Fm 的轉(zhuǎn)變被認(rèn)為反映了光化學(xué)誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，這種變化在體內(nèi)“對(duì)大部分Fv 負(fù)責(zé)”。鑒于本研究的結(jié)果，這種 Fv 對(duì)從 Fo 到 Fm(或 P)的整體增加的貢獻(xiàn)似乎僅適用于 I₁-I₂階段。然而，這不僅可以通過 DCMU 消除，而且還可以通過在黑暗中預(yù)還原 PQ 池來很大程度上抑制。前面得一幅圖中，P、I₁和“額外Fv(I)”的振幅分別為1.63、1.00 和 0.31。假設(shè)在小球藻中 Fv(I) = 2ד額外的 Fv(I)”幾乎沒有 I₁-I₂可能與 Fv 由于光驅(qū)動(dòng)的構(gòu)象變化有關(guān)。然而，不能排除當(dāng)PQ庫在黑暗中還原時(shí)會(huì)引起構(gòu)象變化。任何進(jìn)一步嘗試回答I₁和 I₁-I₂相淬火的起源都超出了本通訊的范圍。

Fv(I)的存在對(duì)淬滅分析的影響

在實(shí)際應(yīng)用中，飽和脈沖猝滅分析具有特殊的價(jià)值，因?yàn)樗�可以評(píng)估樣品在給定光照狀態(tài)下的光合狀態(tài)。在這些條件下，F(xiàn)d下游的反應(yīng)被光激活，F(xiàn)v(I)的干擾被最小化。然而，當(dāng)在暗適應(yīng)后測(cè)量最大Fv/Fm時(shí)，需要特別注意，其中Fv和Fm的值包含大量的I₂-P分量，因此也包含大量的Fv(I)。這個(gè)問題可以通過適應(yīng)低強(qiáng)度背景照明來代替嚴(yán)格的暗適應(yīng)來避免。預(yù)光照應(yīng)激活 Fd下游的反應(yīng)，而不會(huì)引起顯著的能量依賴性非光化學(xué)猝滅NPQ。由此產(chǎn)生的 I₂-P抑制不可避免地導(dǎo)致較低的Fv/Fm值。另一方面，當(dāng)修正F(I)對(duì)Fo的貢獻(xiàn)時(shí)，會(huì)獲得更高的Fv/Fm值。

當(dāng)忽略Fv(I)的存在時(shí)，這可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)光誘導(dǎo)熒光變化的誤解。例如，非光化學(xué)猝滅(NPQ)通常參考暗適應(yīng)后測(cè)量的 Fm 狀態(tài)進(jìn)行量化。當(dāng)在中等光強(qiáng)度下照射時(shí)，最大熒光產(chǎn)量Fm'相對(duì)于Fm下降，這正式導(dǎo)致NPQ增加，而實(shí)際上Fm'的下降是由于光激活抑制I₂-P相 PSI下游的反應(yīng)。在NPQ的定量研究中應(yīng)考慮到這一方面，方法是將暗適應(yīng)后的 I₂水平而不是Fm水平作為參考。

為什么Fv(I)沒有更早被發(fā)現(xiàn)？

90多年前，當(dāng)Hans Kautsky發(fā)現(xiàn)可變Chl熒光時(shí)，當(dāng)時(shí)還沒有關(guān)于存在兩個(gè)光系統(tǒng)的信息。此類信息在30年后逐漸出現(xiàn)，Chl熒光被證明是闡明PSII中水的分裂與PSI受體側(cè)NADP還原之間的各種電子傳輸步驟的先驅(qū)工具。雖然很明顯部分熒光源自PSI，但人們認(rèn)為這是恒定的，僅對(duì)暗熒光Fo 有貢獻(xiàn)。我們現(xiàn)在知道，與Fv(II)相比，F(xiàn)v(I)的振幅確實(shí)很小。此外，F(xiàn)v(I) 僅在相對(duì)較短的時(shí)間窗口(20到200毫秒)內(nèi)用飽和光照射時(shí)瞬態(tài)發(fā)展。最后但同樣重要的是，F(xiàn)v(I)在連續(xù)光照和DCMU 存在下被抑制。雖然DCMU通過阻斷二次電子傳輸在PSII初級(jí)反應(yīng)的研究中非常有價(jià)值，但PSI不存在類似的抑制劑。據(jù)推測(cè)，這是迄今為止Fv(I)尚未被強(qiáng)大的時(shí)間分辨熒光測(cè)量技術(shù)檢測(cè)到的主要原因，在過去的30年中，該技術(shù)已應(yīng)用于許多研究兩個(gè)光系統(tǒng)吸收的激發(fā)能的命運(yùn) 。

原理上，衰變相關(guān)光譜(DAS)允許對(duì)體內(nèi)Chl熒光的特性進(jìn)行詳細(xì)和準(zhǔn)確的分析。PSI和PSII熒光的貢獻(xiàn)可以很容易地根據(jù)它們截然不同的壽命和衰變相關(guān)的激發(fā)和發(fā)射光譜來區(qū)分。然而，當(dāng)作為檢測(cè)Fv(II)的常規(guī)做法添加PSII抑制劑DCMU時(shí)，F(xiàn)v(I)被有效阻止。當(dāng)PSI下游的反應(yīng)被預(yù)光照光激活時(shí)，F(xiàn)v(I)的誘導(dǎo)也會(huì)被阻止。暗適應(yīng)后，必須應(yīng)用非常強(qiáng)的多次周轉(zhuǎn)光脈沖以確保 PSI(鐵氧還蛋白)受體側(cè)的限制關(guān)閉，然后通過光激活再次打開，這在藻類和藍(lán)藻中特別快。另一方面，由于可以預(yù)期Fv(I) 的壽命比 Fo(I) 的壽命長得多，并且相對(duì)于Fv(II) 應(yīng)該有相當(dāng)大的紅移，因此可以通過時(shí)間確認(rèn)其存在。當(dāng)滿足上述要求時(shí)，分辨測(cè)量應(yīng)該不會(huì)太困難。

總結(jié)和結(jié)論

1、Multi-Color- PAM 熒光儀被擴(kuò)展用于使用 FR 脈沖調(diào)制測(cè)量光測(cè)量暗光 Chl 熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。

2、使用該測(cè)量系統(tǒng)，首次在波長> 765 nm處測(cè)量了PSI熒光激發(fā)F(I)的多相上升動(dòng)力學(xué)。

3、對(duì)原始720ex 信號(hào)中包含的相對(duì)較大的恒定背景信號(hào)進(jìn)行量化和校正，因此不僅可以獲取有關(guān)Fv(I) 的定量信息，還可以獲得有關(guān) Fo(I) 的定量信息。

4、按照 Schreiber 和Klughammer (2021) 介紹的方法，重新調(diào)整 720ex 和540ex 響應(yīng)，使其 O-I₁振幅相等，因此所有F(II) 響應(yīng)均等。

5、從O-I₁均衡Fv(720ex)和Fv(540ex) 響應(yīng)之間的差異，推導(dǎo)出選擇性Fv(I)響應(yīng)，對(duì)應(yīng)于720ex 與 540ex相比觀察到的“額外Fv(I)”。

6、分析Fo(I)和Fo(II)對(duì)Fo(720ex)和Fo(540ex)的貢獻(xiàn)表明，在暗適應(yīng)的小球藻中，720ex的Fo(I)/Fo(II)比值比540ex高兩倍，假設(shè)Fo(I)/Fo(II) = 35/65與540ex 的合理比率。

7、假設(shè)Fv(I)/Fv(II)與720ex的比率超過540ex的2倍，推斷在暗適應(yīng)的小球藻中，F(xiàn)v(720ex)中包含的Fv(I)總計(jì)2倍“額外的Fv(I)”。

8、基于此Fv(I)信息，對(duì)Fv(II)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了解卷積，它與原始Fv(720ex)動(dòng)力學(xué)非常匹配，直至約20 ms，F(xiàn)v(I) 開始發(fā)展。此后，F(xiàn)v(II)開始飽和，而Fv(I)在約200 ms時(shí)顯示瞬態(tài)峰值。數(shù)據(jù)支持 I₂-P(或 I-P)階段歸因于Fv(I) 的觀點(diǎn)。

9、正如在小球藻中，取決于實(shí)驗(yàn)條件，不能始終區(qū)分不同的 I₂階躍或拐點(diǎn)，I₂水平被定義為P和I₂水平之間的差異等于Fv(I)振幅，即測(cè)量的“額外Fv(I)。”

10、在較低光化強(qiáng)度下使用720ex和540ex進(jìn)行的暗光感應(yīng)動(dòng)力學(xué)比較測(cè)量表明，當(dāng)無法區(qū)分I₁和I₂水平時(shí)，一些Fv(I) 也隱藏在“經(jīng)典”考茨基效應(yīng)(O-I-P-S 瞬態(tài))的峰值中。

11、發(fā)現(xiàn) DCMU 可以“從上方”抑制I₂-P相位，這與最大 F(II) 由I₂而不是 P(或 Fm)指示的結(jié)論一致。

12、使用540ex 和680-740 nm范圍內(nèi)的各種激發(fā)波長的比較測(cè)量表明，“額外的 Fv(I)”在波長⟩> 680 nm 時(shí)產(chǎn)生，并在約720 nm 處達(dá)到峰值。

13、雖然Fv(I)在“紅降”光譜范圍內(nèi)的發(fā)展定性地與眾所周知的PSI/PSII激發(fā)從PSI和PSII 作用光譜中增加一致，但觀察到F(I)/F(II)激發(fā)比率的2倍系數(shù)和有效PSI/PSII 活性的8-10 倍系數(shù)存在明顯差異。提出了“紅色 Chls”在確定在波長⟩> 765 nm 時(shí)測(cè)量的F(I) 和 F(II) 特性中的可能作用。

14、重新審視了Schreiber 和 Klughammer (2021)中的F > 700與F < 710數(shù)據(jù)，其中F < 710 響應(yīng)中相對(duì)較大的I₂-P振幅似乎反映了“太多”F(I) < 710。精細(xì)分析 這些數(shù)據(jù)顯示Fo(I) > 700/Fo(I) < 710 = Fv(I)⟩> 700/Fv(I) < 710 = 1.48，當(dāng)激發(fā)比F(I)/F(II) = 假設(shè)F < 710 為 35/65。得出結(jié)論，活體內(nèi)F < 710確實(shí)包含比通常假設(shè)更多的F(I)，這與過去10年許多實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的報(bào)告一致，即LHCII是PSI天線系統(tǒng)的組成部分。

15、使用 720ex 和540ex 對(duì)各種不同的光合生物進(jìn)行的比較測(cè)量表明，所有這些生物中都有大量“額外的Fv(I)”。在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特別大的“額外 Fv(I)”(幾乎與 O-I₁相一樣大)，因此似乎特別適合在體內(nèi)進(jìn)一步研究Fv(I)。
 

—— 參考文獻(xiàn) ——

1、Schreiber, U. Light-induced changes of far-red excited chlorophyll fluorescence: further evidence for variable fluorescence of photosystem I in vivo. Photosynth Res (2023).

2、Schreiber, U., Klughammer, C. Evidence for variable chlorophyll fluorescence of photosystem I in vivo. Photosynth Res 149, 213–231 (2021).

 

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