食道癌（EAC）是全球第六高致死率的癌癥。巴雷特食管癥（NDB）是已知的EAC前體病變，表現(xiàn)為食管的正常鱗狀粘膜被柱狀上皮覆蓋。其可經(jīng)歷低度異性增生（LGD）到高度異型增生（HGD），最終發(fā)展到食道癌。在過去的幾十年里，食道癌的發(fā)病率急劇增加。因此迫切的需要更好地了解疾病的病因，并識別新的預(yù)后和預(yù)測性生物標(biāo)志物，以提高患病的生存概率。在本文中，科學(xué)家們選取了17位不同的食道癌患者的樣本，進(jìn)行了綜合的數(shù)據(jù)分析�；�于這些數(shù)據(jù)，共形成了3種生物型，共有119個表達(dá)譜，包括miRNA（51）、mRNA（51）和circRNA（17）。善用這種獨(dú)特的數(shù)據(jù)資源，有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和疾病機(jī)制，進(jìn)行組織和液體活檢的比較，整合編碼和非編碼RNA模式，此外還可以作為其他基于RNA研究的驗(yàn)證方式。此外，在該數(shù)據(jù)集中還可以識別出結(jié)構(gòu)RNA的差異，包括蛋白質(zhì)編碼突變、融合基因和環(huán)狀RNA。該文由比利時根特大學(xué)Katleen De Preter團(tuán)隊(duì)于2022年3月在Nature 子刊scientific data 上發(fā)表。

圖 1 實(shí)驗(yàn)線路設(shè)計

實(shí)驗(yàn)方法：

患者樣本收集
該項(xiàng)目收集4名食道癌患者（EAC），5名高度異型增生患者(HGD)和8名非增生巴雷特食道癥患者(NDB）的共51份血液組織樣本。所用樣本均在治療前采集。組織樣本是在內(nèi)鏡檢查（NDB和HGD）或腫瘤手術(shù)切除（EAC）期間獲得的。從病變組織區(qū)收集至少一個組織樣本被送去進(jìn)行病理檢查。若收集到非目標(biāo)疾病或健康樣本則會使用RNAlater（Qiagen 76104 RNA保存液）進(jìn)行長期保存。血液樣本使用6 ml EDTA管收集，然后用9 ml檸檬酸鈉（3.2%）真空血管進(jìn)行采血。1800g離心10 min制備血漿

RNA提取
組織樣本：采用miRNeasy mini kit （Qiagen 貨號217004）抽提總RNA。提取后的RNA由QUBIT進(jìn)行濃度測定，由安捷倫片段化分析儀進(jìn)行RNA 完整性質(zhì)控。其中高達(dá)70.6%的樣本的RNA完整性水平大于質(zhì)控數(shù)字指標(biāo)7，表示質(zhì)量較好。
血漿樣本：采用miRNeasy Serum/Plasma Kit （Qiagen 貨號217184）提取RNA，其中用來mRNA捕獲測序的樣本還進(jìn)行g(shù)DNA去除。

測序

組織樣本：PolyA+ RNA 測序
采用TruSeq Stranded mRNA Library Prep kit （Illumina）進(jìn)行測序文庫構(gòu)建，上樣量為100 ng。用安捷倫片段化分析儀進(jìn)行文庫質(zhì)控，終文庫在NextSeq 500（Illumina）儀器上進(jìn)行paired-end測序。

血漿樣本：mRNA捕獲測序
使用TruSeq RNA Access Library Prep Kit (Illumina,現(xiàn)已更名為TruSeq RNA Exome)進(jìn)行文庫制備，上樣量為8.5 µl RNA洗脫液。使用安捷倫片段化分析儀進(jìn)行文庫質(zhì)控。樣品在NextSeq 500（Illumina）儀器上進(jìn)行paired-end測序。對所有樣本進(jìn)行了兩次測序，以獲得適當(dāng)?shù)臏y序深度。
 

Small RNA 測序
使用NEBNext  small RNA library prep kit進(jìn)行文庫制備，上樣量為100 ng （組織樣本）和 6 µl 總RNA（血漿樣本）。采用Pippin Prep系統(tǒng)，選擇含有成熟miRNAs（~147-157nt片段）文庫根據(jù)qPCR定量進(jìn)行歸一化并進(jìn)行匯總，并且用乙醇沉淀濃縮，用Qubit 2.0熒光儀定量。在NextSeq 500（Illumina）儀器上對組織和血漿樣本進(jìn)行單端測序。

 圖 2 數(shù)據(jù)的技術(shù)驗(yàn)證 a）RNA原始reads測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量圖：mRNA組織和血漿數(shù)據(jù)的每個堿基平均質(zhì)量（上行），以及miRNA組織和血漿數(shù)據(jù)（下行）； b)基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)的mRNA血漿樣本的分層聚類，顯示了EAC樣本與HGD和NDB樣本的聚類； c）熱圖顯示組織（左）和血漿（右）樣本中35個重疊的不同表達(dá)基因（上下）的相對表達(dá)量； d）血漿中十大豐富環(huán)狀RNA的相對表達(dá)（EAC vs NDB）； e）與匹配的健康食管組織相比，四種最常見的EAC、HGD和/或NDB組織樣本中上調(diào)和下調(diào)的miRNAs

表 1 組織樣本（包括19734個基因和676個miRNAs）和血漿樣本（11255個基因，457個miRNAs和2275個環(huán)狀RNA）的表達(dá)和豐度分析結(jié)果

結(jié)論：
1、基因表達(dá)和豐度分析
對組織和血漿中的mRNA、miRNA和環(huán)狀RNA進(jìn)行了同源基因表達(dá)和豐度分析。不同表達(dá)基因的數(shù)量見表1。預(yù)處理后的數(shù)據(jù)也被上傳到R2 Genomics Analysis and Visualization Platform 中(http://r2.amc.nl)，可對數(shù)據(jù)集的進(jìn)一步探索和可視化。在本研究中，我們在EAC、HGD和NDB患者的血漿中鑒定了幾種環(huán)狀RNA，它們的環(huán)狀結(jié)構(gòu)更能抵抗外切酶的RNA降解，因此這種類型的RNA作為循環(huán)生物標(biāo)記物具有很大的潛力。雖然我們關(guān)注使用小RNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行miRNA表達(dá)和豐度分析，但其他小RNA如tRNA（片段）和piRNA也可以使用我們的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
 

2、相關(guān)miRNA和mRNA的表達(dá)
該數(shù)據(jù)集包含了匹配疾病和健康組織樣本的miRNA和mRNA數(shù)據(jù)。因此，我們在數(shù)據(jù)中可以研究miRNA和mRNA表達(dá)之間的關(guān)系。例如，已知Hedgehog（HH）信號通路在EAC和NDB60中發(fā)揮重要作用。在NDB中，hsa-miR-194表達(dá)的增加導(dǎo)致SUFU的丟失，從而導(dǎo)致Sonic Hegdgehog（SHH）基因的上調(diào)。在我們的NDB組織數(shù)據(jù)以及EAC和HGD組織樣本中，也觀察到與健康組織相比，hsa-miR-194和SHH的表達(dá)上調(diào)，以及SUFU的表達(dá)下調(diào)。這種獨(dú)特的數(shù)據(jù)集可對疾病和健康部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行匹配，以便進(jìn)一步探索相關(guān)通路，即通過使用miRNA和mRNA數(shù)據(jù)。
 

3、突變分析
基于polyA+測序數(shù)據(jù)（組織）和mRNA捕獲測序數(shù)據(jù)（血漿），進(jìn)行突變分析。疾病特異性變異被嚴(yán)格篩選。隨后，這些變異與血漿中的變異進(jìn)行分析。在2例EAC患者、5例 HGD患者和4例NDB患者的血漿中，共發(fā)現(xiàn)了24個變異。每個患者發(fā)現(xiàn)1-7個變異，但在疾病組內(nèi)或組間沒有觀察到重疊。根據(jù)前列腺癌（COSM5564582）、宮頸癌或膽道癌（COSM5493837）或大腸癌（COSM5756079）的COSMIC 數(shù)據(jù)庫，樹狀變異是已知的腫瘤突變。這些結(jié)果證明了該數(shù)據(jù)集能夠在血漿RNA測序數(shù)據(jù)中識別可能的體細(xì)胞突變或疾病特異性RNA編輯事件。
 

4、融合基因分析
EAC組織中融合基因分析的研究報道很少。在本文中，科學(xué)家們展示了檢測EAC、HGD和NDB組織和血漿樣本的融合基因的潛力。在組織樣本中，在所有樣本中都發(fā)現(xiàn)了潛在的融合基因。通過排除（在每個樣本的基礎(chǔ)上）在健康組織中也發(fā)現(xiàn)的融合基因，我們確定了疾病特異性的融合基因。對于所有的樣本，有2-14個融合基因保留（不包括潛在的假陽性）。對于血漿樣本，在一個HGD患者樣本和兩個NDB患者樣本中識別出潛在的融合基因，其中有兩個重疊的融合基因（ID5_HGD和ID19_NDB）。疾病組織與血漿樣本之間沒有融合基因的重疊。科學(xué)家們?nèi)匀恍枰�進(jìn)一步驗(yàn)證這些潛在相關(guān)的融合基因。

本文好物推薦
在文章中科學(xué)家多次使用安捷倫片段化分析儀進(jìn)行樣本RNA完整性以及測序文庫質(zhì)控。該分析儀為平行毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，共有三個型號，5200,5300和5400.以5200型號為例�？稍� 15 分鐘內(nèi)平行分離 12 個樣品。 該系統(tǒng)旨在消除實(shí)驗(yàn)室的瓶頸，讓您更加專注于結(jié)果。5200 片段分析儀系統(tǒng)可對 gDNA、小 RNA、cfDNA、大片段 DNA 和總 RNA 等多種樣品進(jìn)行 DNA QC 和 RNA QC。這些系統(tǒng)可以分離樣品類型的多樣性使這些儀器成為個性化工作流程的理想工具，包括 NGS 文庫 QC 和 CRISPR 工作流程。