8月13日Cell雜志在線發(fā)表了題名“Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers“的文章1，對(duì)426個(gè)人類(lèi)腫瘤和正常樣本開(kāi)展了外泌體蛋白組的研究，鑒別了腫瘤組織和癌癥患者血漿來(lái)源的外泌體特異性表達(dá)的蛋白，發(fā)現(xiàn)這些外泌體蛋白可以診斷癌癥并且可以區(qū)分不同類(lèi)型的癌癥（圖1），為外泌體蛋白組的研究提供了強(qiáng)大的資源數(shù)據(jù)庫(kù)。

 

圖1外泌體蛋白組學(xué)

該研究對(duì)426個(gè)人類(lèi)樣本和71個(gè)小鼠樣本利用超速離心的方法分離外泌體，通過(guò)LC-MS/MS進(jìn)行外泌體蛋白組研究。通過(guò)質(zhì)譜結(jié)果分析，在所有外泌體中平均有862個(gè)蛋白，不管是腫瘤還是正常樣本，蛋白含量最多的是人和小鼠組織外植體來(lái)源的外泌體，最少的是血漿和血清來(lái)源的外泌體（圖2a-c）。對(duì)比不同類(lèi)型樣本發(fā)現(xiàn)除了人腫瘤細(xì)胞系上清外泌體含有的蛋白量比正常細(xì)胞系外泌體中的少之外，其他類(lèi)型的腫瘤和正常樣本外泌體含有的蛋白數(shù)量并無(wú)差異（圖2d）。

圖2 MS鑒別的不同樣本來(lái)源的外泌體蛋白數(shù)量

研究者對(duì)傳統(tǒng)常用的11個(gè)外泌體marker進(jìn)行了定性分析（圖3a）。在人類(lèi)細(xì)胞系來(lái)源的外泌體中，除了CD63，其他的蛋白都出現(xiàn)在超過(guò)一半的樣本中。同樣在人組織外植體來(lái)源的外泌體中，CD63和TG101除外，其他的蛋白也都在超過(guò)一半的樣本中出現(xiàn)。但是在人血漿來(lái)源的外泌體中，僅僅只有HSPA8和CD9在超過(guò)一半的樣本中出現(xiàn)。在超過(guò)一半的血清來(lái)源外泌體中出現(xiàn)的marker，也僅只有HSPA8，Alix和CD9。這些marker在這些樣本中差異性表達(dá)也應(yīng)對(duì)了這些樣本間蛋白數(shù)量的差異（圖2）。這些結(jié)果說(shuō)明這些傳統(tǒng)的marker或許在外泌體鑒定中效果并不是很好。因此研究者在質(zhì)譜結(jié)果中篩選出了13個(gè)出現(xiàn)在超過(guò)50%人的所有樣本中的蛋白作為外泌體新的候選marker（圖3b）。

圖3 對(duì)比分析常用和新的外泌體marker

研究者又分別分析了胰腺癌組織和癌旁組織，及肺癌組織和癌旁組織，遠(yuǎn)端組織來(lái)源的外泌體蛋白組差異。通過(guò)某些篩選原則，研究者發(fā)現(xiàn)了356個(gè)胰腺癌組織高表達(dá)的蛋白（圖4a），126個(gè)肺癌組織高表達(dá)的蛋白（圖4b）。

 

圖4 腫瘤組織外泌體高表達(dá)的Top30蛋白

基于特定的篩選原則，研究者又發(fā)現(xiàn)了51個(gè)胰腺癌血漿外泌體特異表達(dá)的蛋白（圖5a），19個(gè)肺癌血漿外泌體特異性的蛋白（圖5b）。和組織來(lái)源的外泌體比對(duì)，發(fā)現(xiàn)癌癥患者血漿外泌體特異表達(dá)的蛋白有的來(lái)源于癌組織，有的來(lái)源于癌旁組織。還有的只在血漿外泌體中表達(dá)，這些可能來(lái)源于免疫細(xì)胞。這些結(jié)果說(shuō)明癌癥是一個(gè)系統(tǒng)性疾病，會(huì)影響機(jī)體多個(gè)組織器官變化，共同造成癌癥特有的血漿外泌體蛋白組。

 

圖5 腫瘤患者血漿外泌體特異性蛋白和組織對(duì)應(yīng)關(guān)系

最后研究者發(fā)現(xiàn)組織和血漿來(lái)源的外泌體蛋白組不僅可以區(qū)分診斷癌癥和非癌癥（圖6a,b），而且可以將不同類(lèi)型的癌癥進(jìn)行區(qū)分（圖6c,d）。

圖6 外泌體蛋白組可以診斷不同癌癥

這項(xiàng)研究系統(tǒng)性的分析了多種癌癥組織及血漿來(lái)源的外泌體蛋白組，為相關(guān)的研究提供了寶貴的資源性數(shù)據(jù)。作為外泌體研究領(lǐng)域的從業(yè)者，我們不僅看到這項(xiàng)研究的價(jià)值，同時(shí)我們?cè)谶@也發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)問(wèn)題，在這里呈現(xiàn)給大家一起來(lái)思考：

（1） 本研究中血漿和血清樣本量從0.4-6ml不等，這樣一個(gè)較為寬泛的體積會(huì)不會(huì)對(duì)樣本間的外泌體蛋白組產(chǎn)生影響？其實(shí)已有研究表明了樣本起始的量是會(huì)影響外泌體蛋白的檢測(cè)效果2。

（2） 為什么血漿和血清來(lái)源的外泌體中蛋白含量很少？是不是和樣本起始量有關(guān)？本研究利用5微克血漿和血清外泌體蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，這樣少量的總蛋白是不是也是導(dǎo)致鑒定蛋白數(shù)量少的原因？另外改變分離方法是不是可以增加外泌體的總蛋白量，例如qEV方法比超速離心得到的外泌體總蛋白量要高。

（3） 在樣本間外泌體蛋白數(shù)量不一致的情況下，在所有樣本間對(duì)外泌體marker進(jìn)行定性分析是不是合理？例如新的候選marker，F(xiàn)N1，在胰腺癌組織和癌旁組織間對(duì)比，特異性表達(dá)在癌組織外泌體，癌旁組織外泌體中極少表達(dá)（圖4）。

（4） 不同癌組織樣本間的數(shù)量差異很大，有的癌組織樣本只有1例（圖9），這會(huì)不會(huì)影響診斷癌癥的外泌體蛋白篩選（圖6a,b）。

 

圖9

（5） 本研究篩選出了血漿外泌體中大量的免疫球蛋白可以診斷癌癥。其實(shí)有研究表明了血漿中的IgG主要和外泌體富集在一起3，免疫球蛋白可以和外泌體表明攜帶的抗原結(jié)合4。那么我們?cè)诜治鐾饷隗w蛋白組數(shù)據(jù)時(shí)，什么情況下將免疫球蛋白作為高豐度蛋白剔除，在什么情況不剔除？

（6） 本研究在確定血漿外泌體蛋白來(lái)源時(shí)，是和體外培養(yǎng)的組織上清中分離的外泌體蛋白組進(jìn)行比對(duì)。任何組織在體內(nèi)環(huán)境中都可能與其他組織或器官形成互動(dòng)，體外培養(yǎng)的組織再分泌的外泌體是否能夠體現(xiàn)這種互動(dòng)性？是否通過(guò)與膠原酶等消化組織獲得的組織間隙外泌體比對(duì)，才更能代表組織在機(jī)體環(huán)境中分泌外泌體的真實(shí)情況？

在這樣一個(gè)學(xué)術(shù)百家爭(zhēng)鳴的時(shí)代，華盈生物作為多年從事外泌體研究和科研服務(wù)的標(biāo)桿企業(yè)，我們珍視每一次重要科學(xué)成果的發(fā)布對(duì)整個(gè)領(lǐng)域帶來(lái)的啟發(fā)，我們更希望通過(guò)與所有從業(yè)者的互動(dòng)和交流，為解決外泌體研究中目前面臨的種種問(wèn)題提供思路和方案。當(dāng)然，華盈生物也是在不斷實(shí)踐中探索前行，我們建立了穩(wěn)定的外泌體蛋白組技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，希望能夠通過(guò)與業(yè)內(nèi)人士進(jìn)行廣泛地合作， 揭開(kāi)外泌體蛋白組研究的一個(gè)個(gè)謎團(tuán)。

 

圖7 華盈生物外泌體蛋白標(biāo)志物研發(fā)服務(wù)平臺(tái)

|   相關(guān)文獻(xiàn)

1. Ayuko Hoshino, Han Sang Kim, Linda Bojmar et al., Extracellular Vesicle and Particle Biomarkers Define Multiple Human Cancers. [J]. Cell, 2020;S0092-8674(20) 30874-6.  

2. Josselin Caradec, Geetanjali Kharmate, Elham Hosseini-Beheshti et al., Reproducibility and efficiency of serum-derived exosome extraction methods. [J]. Clin Biochem. 2014;47(13-14):1286-1292. 

3. Chao Huang, Kiera P Fisher, Sandra S Hammer et al., Plasma Exosomes Contribute to Microvascular Damage in Diabetic Retinopathy by Activating the Classical Complement Pathway. [J]. Diabetes. 2018;67(8):1639-1649. 

4. Michela Capello, Jody V Vykoukal, Hiroyuki Katayama et al., Exosomes harbor B cell targets in pancreatic adenocarcinoma and exert decoy function against complement-mediated cytotoxicity. [J]. Nat Commun. 2019;10(1):254.