外泌體多參數(shù)綜合表征定量分析在數(shù)據(jù)質(zhì)量、靈活性與速度提升的詳解
近日，英國Oxford Nanoimaging公司專為外泌體（Exosome）研究量身定制的多參數(shù)綜合表征定量分析解決方案全新升級，升級后的試劑盒EV Profiler Kit V2可以超分辨率精度量化納米級小型、稀有和珍貴的外泌體樣品，幫助您全面關(guān)注外泌體族群問題。EV Profiler Kit V2試劑盒主要優(yōu)勢歸納如下：
01.精準識別和確定外泌體尺寸
國際細胞外囊泡協(xié)會發(fā)布的MISEV指南概述了蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)標記物在共定位時的組合可以為單顆粒測量的標記提供更大的EV特異性證據(jù)。EV Profiler V2試劑盒中含有的Pan-EV染色，是Oxford Nanoimaging公司專門開發(fā)的一種基于凝集素、可標記外泌體膜糖蛋白的染料，與針對常見四次跨膜蛋白標志物（CD9、CD63和CD81）的經(jīng)驗證的抗體一起，能精準識別外泌體并確定外泌體群體的大小分布。
圖1. Pan-EV 染色標記的HCT116細胞系來源的外泌體圖像
圖2.Pan-EV染色確定不同外泌體群體的大小
圖1顯示了用Pan-EV染色（黃色）、抗CD63（青色）和抗CD81（品紅色）標記的HCT116細胞系來源的外泌體。圖2顯示了大小基于四跨膜蛋白（左）或Pan EV信號（右）的兩種不同的外泌體群體。
02.在同一樣本上檢測外泌體物質(zhì)運輸和表面生物標志物
EV Profiler Kit V2試劑盒可以檢測和量化單個外泌體水平上的物質(zhì)運輸以及表面生物標志物。同一樣本中可檢測3個標志物。
圖3.ONI Pan-EV 染色HCT116衍生的外泌體
HCT116來源的外泌體用488標記的ONI Pan-EV染料染色，四次跨膜蛋白組合Tetraspanin Trio（anti-CD9, anti-CD63 and anti-CD81）用568共同染色，anti-Syntenin-1用647染色。圖3顯示了任一或兩種標記物陽性的外泌體中四次跨膜蛋白的數(shù)量或Syntenin-1計數(shù)。
03.評估外泌體形態(tài)
單分子定位顯微鏡與適當?shù)臒晒鈽擞浱结樈Y(jié)合使用，有助于評估純化后外泌體群體和單個外泌體的完整性和形態(tài)。EV Profiler Kit V2試劑盒中的Pan-EV染色結(jié)合ONI公司獨特的CODI云平臺上基于聚類的分析模塊，可以報告外泌體的形態(tài)特征，如大小和形狀等。
04.群體→單個，對外泌體跨尺度特征化
每個EV Profiler Kit V2包含足夠的材料，其中的4通道分析芯片已針對外泌體捕獲進行了充分地開發(fā)和優(yōu)化，可以分析12個外泌體樣本。您可以使用適當?shù)牟东@方法從任何給定來源捕獲數(shù)百個外泌體，并對其進行成像，將單個外泌體放大，還可以查看單個外泌體水平上的生物標志物分布。
圖5. 外泌體群體及單個成像
借助Nanoimager和CODI平臺可實現(xiàn)外泌體樣本的成像和視覺檢查。在數(shù)千個外泌體種檢查其中一個外泌體時，標尺范圍從10µm到50 nm不等。圖5這些外泌體是用ONI的S4分子捕獲的HCT116來源的外泌體樣品成像，并用Pan-EV染色（黃色）、anti-CD63-568（青色）和anti-CD81-647（品紅色）標記。
05.快速獲得結(jié)果
EV Profiler V2試劑盒包含用于捕獲、固定和染色外泌體所有必要的試劑。然后借助Nanomimager獲得單分子定位數(shù)據(jù)和納米級分辨率圖像，通過CODI平臺對這些數(shù)據(jù)進行分析，在幾個小時就可以得到對單個外泌體成像的結(jié)果。該工作流程適用于低至10µL的外泌體樣本量。
圖6. 單個外泌體成像工作流程
06.更大的樣品靈活性
EV Profiler V2試劑盒為外泌體捕獲提供了3種選擇：
（1）基于四次跨膜蛋白的捕獲。ONI驗證了針對四次跨膜蛋白的捕獲抗體：試劑盒中包括抗CD9、抗CD63和抗CD81抗體。
（2）磷脂酰絲氨酸依賴性、蛋白質(zhì)非依賴性捕獲。專有的S4捕獲分子可以與蛋白質(zhì)無關(guān)的方式結(jié)合外泌體，這對富含磷脂酰絲氨酸的外泌體十分有效。
（3）自定義基于目標的捕獲。根據(jù)您的目標蛋白來選擇相應的抗體——它只需要被生物素化（樣本由Nicole Meisner Kober博士的實驗室提供）。
圖7.EV Profiler V2試劑盒三種捕獲方式
在EV Profiler V2試劑盒中，包括標準四次跨膜蛋白標記物（CD9、CD63和CD81）的抗體，其與Tetraspanin Trio使用的相同熒光團組合，使得研究人員能夠在需要時使用兩個通道來獲得自己感興趣的生物標志物。EV Profiler V2試劑盒是一個模塊化試劑盒，您可以將其中的抗體替換為與自己的目標蛋白相對應的抗體。
07.外泌體分析和量化變得更簡單
CODI云平臺內(nèi)專門構(gòu)建的分析工具，可以無縫處理單分子定位數(shù)據(jù)，獲得輸出匯總數(shù)據(jù)的文件，如每個樣本的生物標志物陽性率、外泌體尺寸分布、每個外泌體的生物標志物密度（定位/聚類）、外泌體形態(tài)參數(shù)、從外泌體樣本導出高分辨率三色圖像等。
圖8.CODI云軟件上的單分子數(shù)據(jù)聚類
圖8顯示了使用EV Profiler Kit V2試劑盒，Nanoimager拍攝的圖片。CODI云平臺使用單分子數(shù)據(jù)的聚類，可以幫助評估外泌體形態(tài)學特征并確定不同生物標志物的陽性水平。
總的來說，與第一代多參數(shù)綜合表征定量分析解決方案相比，EV Profiler V2試劑盒在數(shù)據(jù)質(zhì)量、靈活性、速度方面都有著巨大的提升。如果您想了解更多，歡迎聯(lián)系我們。
01.精準識別和確定外泌體尺寸
國際細胞外囊泡協(xié)會發(fā)布的MISEV指南概述了蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)標記物在共定位時的組合可以為單顆粒測量的標記提供更大的EV特異性證據(jù)。EV Profiler V2試劑盒中含有的Pan-EV染色，是Oxford Nanoimaging公司專門開發(fā)的一種基于凝集素、可標記外泌體膜糖蛋白的染料，與針對常見四次跨膜蛋白標志物（CD9、CD63和CD81）的經(jīng)驗證的抗體一起，能精準識別外泌體并確定外泌體群體的大小分布。
圖1. Pan-EV 染色標記的HCT116細胞系來源的外泌體圖像
圖2.Pan-EV染色確定不同外泌體群體的大小
圖1顯示了用Pan-EV染色（黃色）、抗CD63（青色）和抗CD81（品紅色）標記的HCT116細胞系來源的外泌體。圖2顯示了大小基于四跨膜蛋白（左）或Pan EV信號（右）的兩種不同的外泌體群體。
02.在同一樣本上檢測外泌體物質(zhì)運輸和表面生物標志物
EV Profiler Kit V2試劑盒可以檢測和量化單個外泌體水平上的物質(zhì)運輸以及表面生物標志物。同一樣本中可檢測3個標志物。
圖3.ONI Pan-EV 染色HCT116衍生的外泌體HCT116來源的外泌體用488標記的ONI Pan-EV染料染色，四次跨膜蛋白組合Tetraspanin Trio（anti-CD9, anti-CD63 and anti-CD81）用568共同染色，anti-Syntenin-1用647染色。圖3顯示了任一或兩種標記物陽性的外泌體中四次跨膜蛋白的數(shù)量或Syntenin-1計數(shù)。
03.評估外泌體形態(tài)
單分子定位顯微鏡與適當?shù)臒晒鈽擞浱结樈Y(jié)合使用，有助于評估純化后外泌體群體和單個外泌體的完整性和形態(tài)。EV Profiler Kit V2試劑盒中的Pan-EV染色結(jié)合ONI公司獨特的CODI云平臺上基于聚類的分析模塊，可以報告外泌體的形態(tài)特征，如大小和形狀等。
圖4.CODI分析模塊顯示外泌體的大小和形狀
圖4顯示了兩個疊加圖像的示例，其中A表示較小且較不圓的外泌體，B表示較大且較圓的外泌體。
04.群體→單個，對外泌體跨尺度特征化
每個EV Profiler Kit V2包含足夠的材料，其中的4通道分析芯片已針對外泌體捕獲進行了充分地開發(fā)和優(yōu)化，可以分析12個外泌體樣本。您可以使用適當?shù)牟东@方法從任何給定來源捕獲數(shù)百個外泌體，并對其進行成像，將單個外泌體放大，還可以查看單個外泌體水平上的生物標志物分布。
圖5. 外泌體群體及單個成像
借助Nanoimager和CODI平臺可實現(xiàn)外泌體樣本的成像和視覺檢查。在數(shù)千個外泌體種檢查其中一個外泌體時，標尺范圍從10µm到50 nm不等。圖5這些外泌體是用ONI的S4分子捕獲的HCT116來源的外泌體樣品成像，并用Pan-EV染色（黃色）、anti-CD63-568（青色）和anti-CD81-647（品紅色）標記。
05.快速獲得結(jié)果
EV Profiler V2試劑盒包含用于捕獲、固定和染色外泌體所有必要的試劑。然后借助Nanomimager獲得單分子定位數(shù)據(jù)和納米級分辨率圖像，通過CODI平臺對這些數(shù)據(jù)進行分析，在幾個小時就可以得到對單個外泌體成像的結(jié)果。該工作流程適用于低至10µL的外泌體樣本量。
圖6. 單個外泌體成像工作流程
06.更大的樣品靈活性
EV Profiler V2試劑盒為外泌體捕獲提供了3種選擇：
（1）基于四次跨膜蛋白的捕獲。ONI驗證了針對四次跨膜蛋白的捕獲抗體：試劑盒中包括抗CD9、抗CD63和抗CD81抗體。
（2）磷脂酰絲氨酸依賴性、蛋白質(zhì)非依賴性捕獲。專有的S4捕獲分子可以與蛋白質(zhì)無關(guān)的方式結(jié)合外泌體，這對富含磷脂酰絲氨酸的外泌體十分有效。
（3）自定義基于目標的捕獲。根據(jù)您的目標蛋白來選擇相應的抗體——它只需要被生物素化（樣本由Nicole Meisner Kober博士的實驗室提供）。
圖7.EV Profiler V2試劑盒三種捕獲方式
在EV Profiler V2試劑盒中，包括標準四次跨膜蛋白標記物（CD9、CD63和CD81）的抗體，其與Tetraspanin Trio使用的相同熒光團組合，使得研究人員能夠在需要時使用兩個通道來獲得自己感興趣的生物標志物。EV Profiler V2試劑盒是一個模塊化試劑盒，您可以將其中的抗體替換為與自己的目標蛋白相對應的抗體。
07.外泌體分析和量化變得更簡單
CODI云平臺內(nèi)專門構(gòu)建的分析工具，可以無縫處理單分子定位數(shù)據(jù)，獲得輸出匯總數(shù)據(jù)的文件，如每個樣本的生物標志物陽性率、外泌體尺寸分布、每個外泌體的生物標志物密度（定位/聚類）、外泌體形態(tài)參數(shù)、從外泌體樣本導出高分辨率三色圖像等。
圖8.CODI云軟件上的單分子數(shù)據(jù)聚類
圖8顯示了使用EV Profiler Kit V2試劑盒，Nanoimager拍攝的圖片。CODI云平臺使用單分子數(shù)據(jù)的聚類，可以幫助評估外泌體形態(tài)學特征并確定不同生物標志物的陽性水平。
總的來說，與第一代多參數(shù)綜合表征定量分析解決方案相比，EV Profiler V2試劑盒在數(shù)據(jù)質(zhì)量、靈活性、速度方面都有著巨大的提升。如果您想了解更多，歡迎聯(lián)系我們。
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