用于快速檢測的表面等離子共振儀器——P4SPR是一款非常便利與研究人員快速開發(fā)生物測定方法和進行生物分子相互作用特征分析的日常工具。

下面簡單介紹一下P4SPR的常見應用以及在應用上的優(yōu)勢。

一 DNA-蛋白檢測——基因調(diào)控-Lac操縱子/Lac阻遏物

乳糖操縱子（LacO）是參與乳糖分解的一個基因群，調(diào)控乳糖代謝相關基因的表達，乳糖阻遏物（LacI）作為一種DNA-結(jié)合蛋白，是控制乳糖操縱子的關鍵。

利用P4SPR可以測定LacO/LacI體系的結(jié)合強度（親和力，KD），其儀器使用簡單，操作界面友好，非常適合實驗室技術人員開發(fā)和本科課程教學。
 

圖 1 SPR信號在不同濃度LacO下隨時間的變化
 

圖 2 增加LacI濃度時的疊加結(jié)合曲線
 

P4SPR成功地表征了Lac操縱子DNA及其抑制蛋白的結(jié)合相互作用，該系統(tǒng)也可以作為表征其他生物系統(tǒng)的有用工具，比如DNA-DNA、DNA-RNA和適配體等。

P4SPR的優(yōu)勢還體現(xiàn)在它具有獨特的模塊化、可移動性和多通道設計，用于藥物發(fā)現(xiàn)、生物/傳感和系統(tǒng)集成應用。并且?guī)缀醪恍枰獦悠分苽�，可以快速和簡單的進行系統(tǒng)設置，同時還可以節(jié)省用戶的試劑成本。

二 小分子檢測——在環(huán)境水域中進行RDX的現(xiàn)場測試

環(huán)三亞甲基三硝銨（RDX）廣泛用于彈藥制造，也是爆炸污染的主要成分。

目前，對于RDX的檢測通常采用實驗室的HPLC-UV檢測法，雖然這種方法十分靈敏，但是因為它需要在測試之前進行取樣、運輸、儲存和樣品準備等工作，因此耗時較長，需要幾天甚至幾周的時間。而利用P4SPR的便攜性可以直接到現(xiàn)場檢測RDX，儀器只需要進行簡單的現(xiàn)場布置就能使用，并且能夠直接檢測，不需要樣品制備，檢測時間通常只需要幾個小時。
 

P4SPR為RDX的現(xiàn)場檢測提供了卓越的分析能力。它的便攜性和穩(wěn)定性使其適用于各種環(huán)境條件下的現(xiàn)場測試，因此還可以廣泛適用于其他污染物的檢測。

三 蛋白質(zhì)-小分子相互作用——跨膜蛋白（TM）的作用機制
CD36是具有多種功能的跨膜蛋白的一部分，它在脂質(zhì)攝取、細胞粘附和病原體感知方面有多種作用。配體/CD36蛋白的相互作用可能介導生物的信號轉(zhuǎn)導。P4SPR具有無標簽傳感和實時監(jiān)測的特點，這在研究生物分子相互作用以闡明通路方面表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢。
 

圖 6 評估與CD36傳感器芯片的小分子相互作用的SPR方法的示意圖
 

圖 7 指示化合物的KD和最大SPR信號（ΔλSPR,max）

P4SPR為了解跨膜蛋白與信息素刺激的作用機制提供了幫助，并且模塊化設計提供了微流控系統(tǒng)，多通道特性提高了結(jié)果的精度，高靈敏度也允許檢測低分子量的小分子物質(zhì)，加上友好的操作界面，P4SPR非常適用于快速獲取實時數(shù)據(jù)來表征分子間結(jié)合的相互作用。

四 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用
急性淋巴母細胞白血�。ˋLL）是一種疾病，大腸桿菌l-天冬酰胺酶（EcAII）作為一種生物治療藥物是被證明對ALL有效的主要化療藥物之一。而患者可以通過產(chǎn)生抗體來中和EcAII，從而降低治療效率。通過P4SPR可以有效檢測抗體并且P4SPR具有可重復的傳感器效率這一特點。

圖 8 EcAII受體的固定化和免疫傳感性能綜述
 

圖 9 EcAII變體的固定化。在注射40 μg蛋白（0.1mgmL−1）的腎折疊酶（黑色）或his標記的EcAII：N21-EcAII（綠色）、N26-EcAII（藍色）和C8-EcAII（紅色）后，觀察EcAII變體表面固定的SPR傳感器圖

P4SPR操作的簡易性可以讓實驗者快速評估分析參數(shù)，比如固定化方法對受體表面覆蓋的影響以及傳感效率。它的多通道性也提高了結(jié)果的精度，而且具有高靈敏度，非常有利于生物樣本中的生物治療藥物的分析。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）技術相比，P4SPR無需對樣品進行標記預處理，并且使用試劑的量更少，制備步驟更簡潔，可以減少檢測的時間和試劑的成本。

五 抗體的快速質(zhì)量檢控
在進行抗體的質(zhì)量檢控時，傳統(tǒng)的ELISA通常只能進行終點分析，而不能提供動力學和親和力數(shù)據(jù)，表面等離子共振（SPR）技術可以實時評估蛋白質(zhì)的相互作用并且不需要太多的樣品制備。

P4SPR作為一種便攜式的SPR設備可以讓科學家更加快速并且容易地獲得有價值的動力學和親和力數(shù)據(jù)以驗證質(zhì)量，而不影響靈敏度和結(jié)合特異性。例如應用P4SPR可以輕松確定哪種抗體與SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白具有最好的結(jié)合性能。
 

圖 10 固定化SARS-CoV-2核衣殼蛋白檢測抗核衣殼抗體的方案
 

圖 11 第一次和第二次注射，同時從每個通道（綠色、紅色、黑色）收集傳感器圖。參考通道為藍色
 

圖 12 所有3個通道（洋紅色）的平均傳感器圖，參考通道為藍色，每個傳感器圖代表了抗核衣殼抗體的不同來源

由于其檢測的高精度和靈敏性，所以無論檢測的蛋白是新的還是儲存了一段時間，P4SPR都可以很好的區(qū)分其高活性和低活性，并且不需要太多的抗體樣品制備，可以直接注射到儀器中，能快速確定哪個抗體源應該用于進一步的實驗。因此，P4SPR也為其他類型的生物制藥產(chǎn)品進行質(zhì)量控制提供了一個快速和簡單的替代方案。

六 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的快速篩選
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPIs）幾乎是幾乎每一個生物過程的核心。在當對自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析時，就發(fā)現(xiàn)了幾十種相互作用。

而繪制生物體的相互作用圖譜是一項艱巨的任務。目前常用的高通量技術來繪制圖譜很費力并且容易產(chǎn)生假陽性。SPR技術可以很好的彌補這一不足。

例如腸桿菌素是一種小分子鐵螯合劑，其生物合成途徑由6種蛋白質(zhì)EntA-F組成。由于已經(jīng)確定EntB和EntE在這一生物合成途徑中相互作用，因此很可能有其他的PPIs發(fā)生。P4SPR可用于篩選參與大腸桿菌中腸桿菌素生物合成的PPIs。
 

圖 13 傳感器圖顯示了固定化蛋白質(zhì)和注射的配體之間發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用（紅色和白色），或沒有相互作用（綠色和藍色）

P4SPR還可以進行更多的PPI篩選，快速、準確的PPI篩選能力非常有助于治療靶點的發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)。

七 片段化合物與蛋白質(zhì)相互作用——藥物發(fā)現(xiàn)
基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)已被確定為一種識別小化合物的策略，可進一步發(fā)展為先導物和臨床候選物。平衡解離常數(shù)（KD）表明了一個片段（或配體）與在靶標疾病中起關鍵作用的蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力的程度，是一重要檢測參數(shù)。

傳統(tǒng)的微量熱泳動技術（MST）、核磁共振技術（NMR）和等溫滴定量熱法（ITC）經(jīng)常用于驗證潛在的片段篩選。但是MST需要熒光標記，而疏水熒光團可能通過非特異性結(jié)合干擾配體-蛋白質(zhì)的相互作用；ITC的通量相對較低，需要大量的樣本，而且運行每個樣本可能需要幾個小時；NMR是一種無標簽的方法，但只適合于評估較弱的粘合劑（mM到µM范圍）。

表面等離子體共振（SPR）作為輔助片段篩選驗證的新技術。雖然SPR需要目標蛋白的固定化步驟，但它使用了低數(shù)量的樣本�？梢钥焖賹崟r確定配體-蛋白復合物的親和信息。P4SPR可以在不到2小時內(nèi)提供準確的結(jié)果。
 

圖 14 在P4SPR中測定片段和固定在傳感器芯片上的his標記蛋白之間的KD
 

圖 15 傳感器圖顯示了配體在40µM時與兩個通道中固定化蛋白的實時結(jié)合數(shù)據(jù)（紅色和白色曲線）
 

圖 16 通過繪制RU與µM中濃度的SPR變化來測定KD

P4SPR能夠快速評估片段和蛋白質(zhì)之間的KD。通過4個微流控通道，一次最多注射4個重復樣品可以獲得準確的KD。相同濃度的樣品可以在相同的傳感器芯片上進行注射，從而降低消耗品成本。最重要的是，這些數(shù)據(jù)顯示了在自己的研究實驗室中，省去了預定的步驟，并且連接到我們的KNX2模塊可以測定Kon和Koff以提供動力學數(shù)據(jù)，這是藥物設計的重要參數(shù)。因此，P4SPR非常有助于藥物發(fā)現(xiàn)。

八 疫苗監(jiān)測——血凝素檢測
血凝素（HA）的含量是流感疫苗監(jiān)測的重要指標。目前評估疫苗批次的黃金標準方法是單徑向免疫擴散（SRID）試驗。雖然這一方法從1978年就開始使用，不過仍存在一定的局限性，首先它是一種離線的方法，需要將樣品從流水線取下進行單獨分析，其次，SRID所需的參考血清和抗原試劑可能需要6個月的準備，導致向公眾發(fā)布疫苗批次的時間大大延遲，同時，SRID存在低精度和低通量的不足，并且一次檢測大約需要22小時。

SPR是一種更快速準確的評估流感和其他疫苗效力的方法。

圖 17 在A、B和C通道的三次HA滴定注射以及控制通道D（藍色）的傳感器圖
 

圖 18 HA與抗HA抗體結(jié)合的標準曲線

P4SPR可以通過固定抗HA抗體到芯片上，并使用標準曲線來檢測樣品中HA的數(shù)量。每個樣品只需10分鐘即可獲得數(shù)據(jù)。在疫苗生產(chǎn)過程中，安裝一個在線SPR儀器來實時評估疫苗批次將是有利的。