抗體的質(zhì)量受pH、溫度、和細(xì)胞培養(yǎng)代謝物等工藝參數(shù)的影響[1]�？贵w等生物藥需要進(jìn)行質(zhì)量控制，以確保質(zhì)量和安全。這些生物藥不僅需要通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜等物理化學(xué)方法進(jìn)行表征，而且還必須研究它們的生物活性。傳統(tǒng)方法例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）[1] [2]）被用于活性測(cè)定。然而，這些檢測(cè)不能提供動(dòng)力學(xué)和親和力數(shù)據(jù)[1]。另一種方法是表面等離子體共振（SPR）技術(shù)。SPR是一種表征蛋白質(zhì)的強(qiáng)大技術(shù)，作為一種無(wú)標(biāo)記技術(shù)，利用它可以實(shí)時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，并且樣品使用量少[2]。大型SPR系統(tǒng)已被用于蛋白質(zhì)質(zhì)量控制[2] [3]。盡管如此，大型SPR設(shè)備的使用仍然有限，儀器需專人使用，操作復(fù)雜，耗材成本高[4]。另一方面，個(gè)人型SPR設(shè)備可以讓科學(xué)家快速的檢測(cè)樣品，輕松獲得驗(yàn)證質(zhì)量所需的有價(jià)值的動(dòng)力學(xué)和親和力數(shù)據(jù)，而不影響靈敏度和特異性。

在本應(yīng)用中，我們演示了如何使用個(gè)人型SPR設(shè)備（P4SPR™）輕松確定哪種來(lái)源的抗核衣殼抗體與SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白具有最佳的結(jié)合性能。

實(shí)驗(yàn)流程

 

Djaileb等人在ChemRXiv論文中描述了更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程[6]。圖1顯示了固定SARS-CoV-2核衣殼蛋白檢測(cè)抗核衣殼抗體的方案。通常，金傳感器表面用Afficoat[4]修飾。用EDC / NHS處理，然后用醋酸鈉洗滌。將SARS-CoV-2核衣殼重組（rN）蛋白溶液（10μg/ mL）添加到表面并處理20分鐘；再次用醋酸鈉洗滌。蛋白質(zhì)修飾的表面被1M乙醇胺封閉10分鐘（pH 8.5）以減少非特異性吸附。通過(guò)運(yùn)行緩沖液（RB）對(duì)其進(jìn)行平衡。隨后，將來(lái)自不同來(lái)源的抗體制造商的抗核衣殼抗體溶液（10 μg/mL）（表1）手動(dòng)注入傳感器，并在每個(gè)通道（圖2，通道A-C）收集SPR響應(yīng)信號(hào)，一次進(jìn)樣獲得3次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。在引入新的抗體溶液之前，使用運(yùn)行緩沖液和甘氨酸溶液進(jìn)行洗滌。使用AntiRBD（受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域）作為對(duì)照（圖2，通道D），以校正溫度和體折射率的任何波動(dòng)。SPR偏移的差異根據(jù)測(cè)量開(kāi)始到結(jié)束的共振單位（RU）差異確定[6]。
 

結(jié)果和討論

整個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)試4種不同來(lái)源的抗體抗核衣殼所花費(fèi)的總時(shí)間2.5小時(shí)。每次注射的平均時(shí)間約為18分鐘，注射和再生的平均總時(shí)間為25分鐘。
 

圖3顯示了所有3個(gè)樣品通道中抗核衣殼抗體第一和第二來(lái)源的SPR響應(yīng)�？梢郧宄�地看到抗核衣殼抗體與SARS-CoV-2核衣殼重組蛋白的互作響應(yīng)。
 

圖4顯示了所有四次進(jìn)樣的平均信號(hào)曲線圖。
 

圖5顯示了各種來(lái)源（按進(jìn)樣順序）的抗核衣殼抗體（即淺藍(lán)色的RU強(qiáng)度）互作強(qiáng)弱。很明顯，AB1，批次B（注射#2）表現(xiàn)出最高的SPR響應(yīng)或活性。此外，值得注意的是，如果使用濃度梯度的抗體或分析物，還可以通過(guò)手動(dòng)進(jìn)樣輕松確定解離平衡常數(shù)（KD），例如[參見(jiàn)應(yīng)用筆記– 基因調(diào)控，Lac操縱子/Lac阻遏因子（DNA-蛋白結(jié)合）]/（或者將這篇文章的鏈接放這兒）。

P4SPR優(yōu)勢(shì)

Affinité 儀器的 P4SPR™ 是一種用戶友好型儀器，可用于對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行一般質(zhì)量控制。無(wú)論蛋白質(zhì)供應(yīng)來(lái)自新供應(yīng)商還是已經(jīng)儲(chǔ)存了一段時(shí)間，P4SPR™都可以輕松區(qū)分高活性和低活性蛋白質(zhì)。此外，抗體樣品不需要復(fù)雜的樣本制備，可以稀釋后直接注射樣到儀器中。由于其多通道的功能設(shè)計(jì)，P4SPR 可提供快速、實(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)和精度。

結(jié)論
很明顯，個(gè)人型SPR儀器可以快速對(duì)抗體進(jìn)行質(zhì)控，從而選擇哪種抗體更適合于下一步的實(shí)驗(yàn)。這樣可有效保障研究者的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。同時(shí)，P4SPR也為生物制藥產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制提供了一種快速簡(jiǎn)便的方案。

參考文獻(xiàn)
1. M. Zschatzsch, Paul Ritter, Anja Henseleit,Klaus Wiehler, Sven Malik, Thomas Bley,Thomas Walther, Elke Boschke, "Monitoringbioactive and total antibody concentrationsfor continuous process control by surfaceplasmon resonance spectroscopy," Eng. LifeSci., vol. 19, pp. 681-690, 2019.

2. Pranavan Thillaivinayagalingam, JulienGommeaux, Michael McLoughlin, DavidCollins, Anthony R. Newcombe,"Biopharmaceutical production: Applicationsof surface plasmon resonance biosensors," J.Chromatogr. B, vol. 878, pp. 149-153, 2010.

3. C. Gassner, F. Lipsmeier, P. Metzger, H. Beck, A.Schnueriger, J.T. Regula, J. Moelleken,"Development and validation of a novel SPRbased assay principle for bispecific molecules,"J. Pharm. Biomed. Anal., vol. 102, pp. 144-149,2015.

4. "Affinité Instruments," [Online]. Available:https://affiniteinstruments.com/

5. H. Wang, Jing Shi, Youchun Wang, Kun Cai, QinWang, Xiaojun Hou, Wei Guo, Feng Zhang,"Development of biosensor-based SPRtechnology for biological quantification andquality control of pharmaceutical proteins," J.Pharm. Biomed. Anal., vol. 50, pp. 1026-1029,2009.

6. Abdelhadi Djaileb, Benjamin Charron, MaryamHojjat Jodaylami, Vincent Thibault, JulienCoutu, Keisean Stevenson, Simon Forest,Ludovic S. Live, Denis Boudreau, Joelle N.Pelletier, Jean-Francois Masson, "A Rapid and Quantitative Serum Test for SARS-CoV-2 Antibodies with Portable Surface Plasmon Resonance Sensing,"http://doi.org/10.26434/chemrxiv.12118914.v1, April 15, 2020.