非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD) 是一種常見的健康問題，其患病率在全球范圍內(nèi)迅速增加。眾所周知，包括遺傳和環(huán)境因素在內(nèi)的多種因素會導(dǎo)致 NAFLD 的發(fā)展。信號素是細(xì)胞外信號蛋白，信號素 7A (SEMA7A)是一種糖基磷脂酰肌醇錨定膜蛋白；初步研究表征了SEMA7A 突變的小鼠的肝細(xì)胞出現(xiàn)水腫和脂肪變性，推測 SEMA7A 突變可能導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂和 NAFLD 發(fā)展。
 

2022年8月，陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院（又名西南醫(yī)院）柴進(jìn)課題組在JCI insight （IF 9.484）上發(fā)表題為“SEMA7A^R148W mutation promotes lipid accumulation and NAFLD progression via increased localization on the hepatocyte surface”的研究文章。本項(xiàng)目利用蛋白質(zhì)組學(xué)和靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究了Sema7a^R145W 突變（相當(dāng)于人類 SEMA7A^R148W）造成小鼠肝臟的脂質(zhì)沉積的分子機(jī)制，表明SEMA7A^R148W 突變是 NAFLD 的重要的遺傳決定因素，并通過增強(qiáng)蛋白激酶 C（PKC-α）信號傳導(dǎo)引起小鼠肝內(nèi)脂滴積聚。針對肝臟 中PKC-α 信號的靶向抑制，有望成為新的 NAFLD 療法。中科新生命為其提供了TMT蛋白組學(xué)，脂質(zhì)組學(xué)，靶向代謝組（中長鏈脂肪酸）檢測的技術(shù)服務(wù)。

 研究材料

NAFLD患者活檢肝臟樣本；野生型（WT），Sema7a^R145W雜合子和純合子小鼠肝臟

 

 技術(shù)路線

步驟1：肝臟活檢分析SEMA7A 雜合子突變與NAFLD嚴(yán)重程度相關(guān)；

步驟2：通過Sema7a^R145W突變小鼠，進(jìn)一步研究 SEMA7A 突變在 NAFLD中的作用；

步驟3：中長鏈脂肪酸檢測發(fā)現(xiàn)純合突變小鼠肝臟中FA和TG增加；

步驟4：蛋白質(zhì)組學(xué)、qPCR和WB發(fā)現(xiàn)Sema7a^R145W調(diào)控脂質(zhì)合成關(guān)鍵基因與激酶；

步驟5：qPCR 和蛋白質(zhì)印跡分析表明Sema7a^R145W突變增加其在膜上表達(dá)，并激活肝細(xì)胞中的PKC-α信號傳導(dǎo)。

 

 研究結(jié)果

1. SEMA7A 雜合突變與NAFLD嚴(yán)重程度顯著相關(guān)

為了探究SEMA7A 突變是否是NAFLD的潛在危險(xiǎn)因素，研究人員分析了470 名 NAFLD患者，找出17名具有SEMA7A雜合突變的肝臟樣本及13名配對的對照肝臟樣本。肝臟組織學(xué)分析顯示，具有 SEMA7A 雜合突變的 NAFLD 患者的脂肪變性和 NAS 的嚴(yán)重程度顯著高于其匹配的對照組。

圖1 伴或不伴 SEMA7A 雜合突變的配對 NAFLD 患者的基線特征

 

2. Sema7a^R145W雜合突變小鼠的NAFLD嚴(yán)重程度和肝功能水平顯著升高

為了進(jìn)一步研究SEMA7A 突變在 NAFLD 進(jìn)展中的功能作用，構(gòu)建了Sema7a^R145W（相當(dāng)于人類 SEMA7A^R148W）雜合子小鼠。在用高脂飲食 (HFD) 喂養(yǎng) 26 周后，我們發(fā)現(xiàn)雜合子小鼠的體重，肝臟重量和肝臟/體重比均顯著高于對照組。組織學(xué)評估顯示Sema7a^R145W雜合子小鼠中的肝脂滴和NASs也顯著增加。與對照組相比，肝臟TG，總膽固醇（Tch）以及血清ALT和AST的水平顯著增加。因此，Sema7a^R145W雜合子突變促進(jìn)了小鼠NAFLD的進(jìn)展。
 

圖2 Sema7a^R145W雜合子突變促進(jìn)HFD喂養(yǎng)后小鼠NAFLD的進(jìn)展

 

3.  Sema7a^R145W突變可增強(qiáng)小鼠肝臟中的FA和TG合成以及FA攝取

收集10 周齡的雄性 WT 和 Sema7a^R145W 純合子小鼠（每組 n = 4）的肝臟樣本，通過中長鏈脂肪酸的靶向代謝組學(xué)和定量脂質(zhì)組學(xué)分析表明，與對照組相比，Sema7a^R145W純合突變顯著增加了小鼠肝臟 FA 和 TG聚積。

 

圖3 靶向代謝組和脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析
 

接下來，標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，在 5874 個(gè)定量蛋白質(zhì)中，232 個(gè)蛋白被上調(diào)，260 個(gè)蛋白被下調(diào)。通過實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR) 和蛋白質(zhì)印跡分析表明，Sema7a^R145W純合突變上調(diào)了FA 和 TG 合成的關(guān)鍵基因（Acaca/Acc1、Fasn、Scd1、Gpat 和 Lipin2）、FA攝取基因（Cd36、Fatp5 和 Caveolin1）和 FA 分解代謝基因（Plin3、Plin5 和 Cpt1β）。這些數(shù)據(jù)表明 Sema7a^R145W突變增強(qiáng)了小鼠肝臟 FA 和 TG 合成以及 FA 攝取。

圖4 蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果、火山圖和KEGG通路注釋

圖5 Sema7a^R145W突變增加了小鼠肝臟中的FA和TG合成以及FA攝取

 

4. Sema7a^R145W突變通過增強(qiáng) PKC-α 信號傳導(dǎo)，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子 Srebp1 和 Chrebp 以及核受體 Lxr 的表達(dá)，增強(qiáng)肝臟 FA 和 TG 合成和 FA 攝取

研究人員調(diào)研發(fā)現(xiàn)PKC-α 信號傳導(dǎo)介導(dǎo)糖尿病大鼠的脂質(zhì)代謝。通過蛋白表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)核受體Srebp1、Chrebp、Lxr及其靶基因 Acc1、Fasn、Scd1、Cd36 的表達(dá)和PKC-α 磷酸化水平，在 Sema7a^R145W純合子的肝臟和原代肝細(xì)胞中顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，Sema7a^R145W突變通過增加小鼠肝細(xì)胞中 PKC-α磷酸化，增強(qiáng)核 Srebp1、Chrebp 和 Lxr 表達(dá)，從而促進(jìn)FA 和 TG 合成和 FA 攝取。
 

圖6 關(guān)鍵因子的蛋白表達(dá)的相對水平的蛋白質(zhì)印跡分析

 

5. Sema7a^R145W突變增加其在細(xì)胞膜上表達(dá)，并激活肝細(xì)胞中的PKC-α信號傳導(dǎo)

免疫熒光和免疫組織化學(xué)表明 Sema7a^R145W純合突變顯著增加了肝細(xì)胞膜上的Sema7a蛋白。對小鼠原代肝細(xì)胞的膜蛋白進(jìn)行檢測顯示，Sema7a^R145W 純合突變增加了膜上Sema7a 與其受體集成素 β1 蛋白結(jié)合，但與另一種 Sema7a 受體 plexin C1無關(guān)。通過抑制集成素 β1的表達(dá)，可顯著降低 Sema7a^R145W純合小鼠原代肝細(xì)胞中 PKC-α 磷酸化水平以及 Sema7a 和 PKC-α 之間的相互作用，表明 Sema7a^R145W突變通過其受體集成素 β1激活PKC-α信號通路。

圖7 免疫熒光、免疫組化、免疫共沉淀分析結(jié)果

 

 小結(jié)

綜上所述，本文揭示了SEMA7A^R148W突變導(dǎo)致脂質(zhì)在肝細(xì)胞中積累的潛在機(jī)制。首先，SEMA7A^R148W突變增加膜上的Sema7a蛋白，并與其受體集成素β1蛋白結(jié)合，增強(qiáng)肝細(xì)胞中的PKC-α磷酸化水平。其次，激活的PKC-α信號可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子SREBP1和ChREBP以及核受體LXR的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞中的FA和TG合成以及FA攝取，引起肝臟中脂滴的積累，導(dǎo)致NAFLD的發(fā)展。