核酸檢測實驗室自動化的最新發(fā)展和趨勢
名詞縮寫釋義
1、Whole process automation nucleic detection system
（WAS)全過程自動化核酸檢測系統(tǒng)
2、Integrated nucleic acid detection machine
(IDM)集成核酸檢測機(jī)
(POCT)護(hù)理點檢測
4、High-efficiency particulate air filter
(HEPA)高效微�？諝膺^濾器
核酸檢測主要包括三個步驟：
1）核酸提取，
2）擴(kuò)增系統(tǒng)制備，
3）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增。
它主要在分子實驗室的三到四個獨立的封閉區(qū)域內(nèi)完成。為了避免污染，科學(xué)家們穿過一條特殊的走廊，通過封閉區(qū)域之間指定的轉(zhuǎn)移窗口轉(zhuǎn)移材料。然而，隨著核酸檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步，一種操作簡單、耗時少、成本低的新型核酸檢測系統(tǒng)有望問世。這種系統(tǒng)可以應(yīng)用于護(hù)理點檢測（POCT），無需專業(yè)操作員和精密輔助設(shè)備，甚至可以用于戶外社區(qū)診所。因此，整合核酸提取、擴(kuò)增和檢測的 POCT 核酸分析系統(tǒng)的研究已在世界范圍內(nèi)展開。越來越多來自各個領(lǐng)域的研究人員致力于這項研究，并致力于解決核酸檢測應(yīng)用中的許多問題。
隨著 COVID-19 在世界各地的爆發(fā)，核酸檢測需求的突發(fā)性增長給各個國家和機(jī)構(gòu)帶來了巨大壓力。實驗室檢查員每天必須完成數(shù)千到數(shù)萬次核酸檢測。這種高強(qiáng)度的工作和巨大的感染風(fēng)險將導(dǎo)致新的問題和隱患。因此，各個公司和科研機(jī)構(gòu)都開發(fā)了核酸檢測的全過程自動化系統(tǒng)。同時，為了滿足現(xiàn)場快速檢測的需要，還開發(fā)了集成快速檢測儀器。
（1）全過程自動化核酸檢測系統(tǒng)（WAS）
WAS 包括核酸提取、擴(kuò)增系統(tǒng)制備和核酸擴(kuò)增分析模塊。每個模塊相對獨立，通過機(jī)械自動化和集成，所有模塊都由自動化中心控制，以利用自動化甚至無人系統(tǒng)。WAS 具有以下優(yōu)點：自動化程度高；生物安全風(fēng)險低；高通量系統(tǒng)。高通量是這個系統(tǒng)最顯著的特點。
（2）集成核酸檢測機(jī)（IDM ）
WAS 涉及的檢測流程環(huán)節(jié)多，要求一定的空間，影響了其在護(hù)理點檢測（POCT）中的應(yīng)用。IDM 體積小，自動化程度高，生物安全風(fēng)險低。該集成機(jī)器還可以完成核酸檢測的所有程序。然而，與 WAS相比，IDM 是一個獨立的設(shè)備，IDM 中的每個模塊不是獨立的，而是集成到系統(tǒng)中。這兩種檢測系統(tǒng)功能相似，但適用于不同的場景。WAS 由三個或更多模塊組成，該系統(tǒng)通常用于大型醫(yī)院和機(jī)構(gòu)中的大量樣本的快速檢測和篩查。由于占用空間大，該設(shè)備經(jīng)常安裝在獨立的房間或空間中。IDM 是一種獨立的設(shè)備，主要用于社區(qū)檢測機(jī)構(gòu)、現(xiàn)場檢測和 POCT。
02 核酸檢測系統(tǒng)的原理及發(fā)展現(xiàn)狀
核酸檢測自動化系統(tǒng)的組成和原理如圖（Fig.1）所示。根據(jù)工作流程，系統(tǒng)可分為四個獨立工作的模塊：自動分配（分杯）、自動核酸提取、自動擴(kuò)增系統(tǒng)制備和自動擴(kuò)增分析模塊。各模塊之間的物料通過搬運(yùn)裝置（機(jī)械手或?qū)Ｓ幂斔蜋C(jī)）進(jìn)行輸送，各模塊由主控終端通過通信總線進(jìn)行協(xié)調(diào)。為了防止污染和生物安全風(fēng)險，每個模塊或系統(tǒng)獨立采用高效微�？諝膺^濾器（HEPA）來保持負(fù)壓。核酸提取過程旨在從樣本中分離和純化核酸，包括 DNA 和 RNA，以滿足擴(kuò)增要求。PCR或其他技術(shù)用于執(zhí)行特定的核酸擴(kuò)增步驟，并通過測量熒光信號或其他信息來檢測結(jié)果。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測方法越來越多。然而，大多數(shù)核酸檢測的目標(biāo)是從生物樣本中獲得高度純化的核酸模板。核酸模板的質(zhì)量對檢測靈敏度和特異性有重要影響。因此，核酸提取方法是核酸檢測過程中的關(guān)鍵部分。世界各地的研究人員投入了核酸提取的研究和方法開發(fā)，并長期探索提取試劑和材料的應(yīng)用。人們發(fā)明了一系列經(jīng)典的核酸提取方法，如苯酚/氯仿提取法、硅膠基質(zhì)法、磁珠法和陰離子交換法。隨著微加工技術(shù)的進(jìn)步，磁珠提取方法得到了廣泛的認(rèn)可。大多數(shù)核酸檢測儀器都采用了磁珠提取系統(tǒng)。
核酸擴(kuò)增是核酸檢測中最常用的方法，而 PCR 是 DNA 或 RNA 擴(kuò)增中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。PCR 是一種體外酶法合成特定片段的方法。它由幾個連續(xù)反應(yīng)組成，包括高溫變性、低溫退火（復(fù)性）和適當(dāng)?shù)臏囟妊由�。擴(kuò)增產(chǎn)物可以是一種新的模板，允許快速擴(kuò)增目標(biāo) DNA。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、省時。大多數(shù)自動化儀器中的擴(kuò)增方法是實時 PCR。近年來，大量放大步驟和探針的使用使得能夠同時檢測多個目標(biāo)。此外，等溫擴(kuò)增引起了越來越多的關(guān)注。與其他方法相比，該方法成本更低、耗時更少，同時需要更簡單的設(shè)備和更方便的操作。
↑↑圖片為曼森生物自主研發(fā)核酸檢測自動化掃描機(jī)器人
03.主流產(chǎn)品
Mainstream products
大多數(shù)自動化儀器由四個模塊組成：樣品引入、樣品轉(zhuǎn)移、樣品純化和放大檢測。從樣品轉(zhuǎn)移、樣品制備、放大檢測、結(jié)果計算到數(shù)據(jù)上傳的整個過程都可以自動化。大多數(shù)儀器中唯一的手動操作步驟是將試劑耗材和樣品管放入自動儀器中。這些系統(tǒng)是完全自動化的測試平臺，真正實現(xiàn)了“樣本輸入和結(jié)果輸出”，可以應(yīng)用于具有不同測試通量（低、中或高）的實驗室的需要。用戶定義的工作流程和全面的檢測菜單可以同時進(jìn)行多種病原體的檢測。
這些儀器的操作步驟、核酸提取、擴(kuò)增系統(tǒng)制備和 PCR 擴(kuò)增幾乎相同。磁性玻璃珠可以結(jié)合帶負(fù)電荷的核酸，適合在自動化儀器中提取核酸。自動化步驟的目的是移動試劑管和轉(zhuǎn)移液體，不同儀器的操作順序略有不同。雖然在一些系統(tǒng)中已經(jīng)應(yīng)用了幾種等溫擴(kuò)增方法，但 PCR 擴(kuò)增仍然是檢測的首選方法。在這些儀器中，Cobas 8800 具有最大的樣品裝載能力。大樣本裝載能力允許人員離開機(jī)器 8 小時或更長時間，這為該系統(tǒng)提供了過載樣本篩選的明顯優(yōu)勢。Panther Fusion Assays 和 ANAS9850 可以在 8 小時內(nèi)完成 500–600 個樣本的檢測。
GeneXpert Infinity-80 系統(tǒng)（Fig 2c）是最著名的 POCT 產(chǎn)品。POCT 產(chǎn)品的特點是“樣品輸入，結(jié)果輸出”。該儀器由一個特殊的微流控試劑盒和一個積木反應(yīng)模塊組成。樣品制備、核酸提取純化、擴(kuò)增試劑制備、擴(kuò)增檢測均在專用試劑盒中完成。獨立的反應(yīng)單元可以在不受批次限制的情況下進(jìn)行及時檢測。
Cobas 6800/8800（羅氏）（Fig 2a）、NeuMoDxTM 288（Qiagen）（Fig 2b）、Panther Fusion Assays（Hologic）（Fig 2d）、ANAS9850（AmpllyBiotech，中國）（Fig 2e）、AutoMolec 3000/1600（Autobio Diagnostics，中國）、AutraMic mini（Liferiver，中國）（Fig 2g）、AutoSAT（Rendu，中國）（Fig 2h），和高保護(hù)水平核酸自動檢測系統(tǒng)（Cohere，中國）（Fig 2i）。
盡管檢測能力低于其他系統(tǒng)，但在特定條件下仍有廣泛的應(yīng)用前景，例如初級診所和其他沒有分子生物學(xué)實驗室的醫(yī)院。Panther Fusion system 增加了在單一全自動平臺上運(yùn)行實時 PCR、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增（TMA）和 RT-TMA 分析的能力。此外，患者樣本到達(dá)實驗室后，可以立即加載到 Panther 系統(tǒng)進(jìn)行測試，這可以提高效率和工作流程。
ANAS985 于 2015 年獲得 CFDA 批準(zhǔn)。它是中國最早的集成核酸檢測機(jī)。從樣本輸入到 PCR 定量報告的整個過程是自動化的，3 小時內(nèi)可以檢測到 96 個樣本。Rendu 的 AutoSAT 符合儀器的原始管裝載要求。與其他系統(tǒng)不同，該系統(tǒng)的擴(kuò)增方法是等溫擴(kuò)增。這臺機(jī)器可以在 24 小時內(nèi)完成 500-700 次檢測。高保護(hù)水平核酸自動檢測系統(tǒng)由上海 Cohere 電子技術(shù)公司和上�？萍即髮W(xué)共同開發(fā)。結(jié)合機(jī)械自動處理系統(tǒng)，構(gòu)建了一套 P2+生物防護(hù)等級的全自動核酸檢測平臺系統(tǒng)。該檢測系統(tǒng)是專門為 COVID-19 開發(fā)的，該平臺還可以用于高通量無人檢測其他病原體，從而有效降低操作員之間的感染風(fēng)險。該系統(tǒng)可以滿足不同應(yīng)用場景和檢測量的需要。每種產(chǎn)品的性能參數(shù)比較如下（表 1）。
04.核酸自動檢測系統(tǒng)展望
Prospect of automatic nucleic acid detection system
自動檢測系統(tǒng)正朝著更好的特異性、更高的靈敏度、更快的檢測速度和更低的價格發(fā)展。滿足不同應(yīng)用場景的需求將是未來產(chǎn)品開發(fā)的重點。目前，在自動檢測系統(tǒng)中，樣本核酸提取步驟花費(fèi)的時間最多。因此，通過優(yōu)化提取方法和自動化設(shè)備，核酸提取可以節(jié)省時間。同時，可以在系統(tǒng)中使用更合適的生物安全保護(hù)策略，以防止樣本之間的交叉污染，降低生物安全風(fēng)險。通過改進(jìn)和優(yōu)化核酸擴(kuò)增技術(shù)，可以提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和敏感性。新興病原體檢測和新亞型檢測的發(fā)展對于滿足不同機(jī)構(gòu)的需求也很重要。結(jié)合 CRISPR 技術(shù)、第三代測序、生物傳感器、納米技術(shù)、微流體技術(shù)和其他分析技術(shù)，將實現(xiàn)對不同檢測目標(biāo)的更精確檢測。還需要進(jìn)一步提高儀器的自動化效率。通過結(jié)合新的信息處理、傳輸技術(shù)和人工智能技術(shù)，這些儀器將更加方便使用。隨著當(dāng)前大流行的全球傳播，對實時診斷技術(shù)的需求正在增加。準(zhǔn)確、快速、易用、易于推廣的實時疾病診斷技術(shù)將成為研究人員關(guān)注的焦點。許多國家投入巨資研發(fā)新的體外診斷產(chǎn)品，并為預(yù)防和控制新出現(xiàn)的傳染病建立了一個可持續(xù)的平臺，以應(yīng)對未來更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
信息來源：：X. Yuan, G. Sui, D. Zhang et al. Recent developments and trends of automatic nucleic acid detection systems.Journal of Biosafety and Biosecurity,Journal of Biosafety and Biosecurity 4 (2022) 54–58
文獻(xiàn)來源 | 本文由中科院上海生命科學(xué)信息中心與上海曼森生物合作供稿
內(nèi)容審核 | 曼森生物郝玉有博士
排版編輯 | 曼森生物劉娟娟編輯
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