熒光定量PCR技術(shù)是將常規(guī)的PCR和熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)初始模板的定量分析。熒光定量PCR技術(shù)作為當(dāng)今生物學(xué)研究的重要手段之一，在基礎(chǔ)科學(xué)、生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)研究、法醫(yī)學(xué)、診斷學(xué)等多方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

說(shuō)到熒光定量PCR技術(shù)，我們經(jīng)常會(huì)問(wèn)類似于“你的實(shí)驗(yàn)是染料法還是探針?lè)?rdquo;，“你用的探針是什么類型”等之類的問(wèn)題，這其實(shí)是對(duì)熒光標(biāo)記的選擇。根據(jù)熒光標(biāo)記的不同，可以將熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分為探針?lè)ê腿玖戏▋纱箢悺?br />  

染料法

染料法利用能與DNA雙鏈結(jié)合的染料來(lái)實(shí)現(xiàn)，如SYBR Green I。該染料在游離狀態(tài)下呈現(xiàn)微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結(jié)合，其綠色熒光增強(qiáng)約1000倍。因此其總的熒光強(qiáng)度與雙鏈DNA含量成正比，利用這一關(guān)系可以反映生成的PCR產(chǎn)物的量（圖 1）。SYBR Green I的最大吸收約在497 nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約在520 nm，與FAM熒光分子的光譜性質(zhì)類似，因此在所有的熒光定量PCR設(shè)備中都是第一通道檢測(cè)，即“FAM/SYBR Green I”通道。
 

▲ 圖1 染料法原理圖
 

理論上，所有能與雙鏈DNA結(jié)合的染料都可以用于qPCR檢測(cè)，如溴化乙錠EtBr，碘化丙啶PI，吖啶橙、Cy3等。而選擇用于qPCR反應(yīng)的染料通常會(huì)從信號(hào)強(qiáng)度、生物安全性、檢測(cè)簡(jiǎn)便性和經(jīng)濟(jì)適用性這幾個(gè)因素考慮。例如EtBr可能存在潛在的致癌性。綜合考慮下來(lái)，SYBR Green I成了比較理想的選擇。目前，使用Evagreen的實(shí)驗(yàn)者也越來(lái)越多，Evagreen作為一種新型的染料，其光譜性質(zhì)與SYBR Green I類似，其優(yōu)勢(shì)在于：
 

▶  對(duì)PCR反應(yīng)的抑制程度小。高濃度SYBR Green I會(huì)強(qiáng)烈抑制PCR反應(yīng)，因此要控制其使用濃度，一定程度上降低了DNA檢測(cè)的靈敏度。
 

▶ 與DNA結(jié)合密度高。單位長(zhǎng)度的DNA雙鏈上Evagreen的密度更高，為飽和型染料，消除了SYBR Green I存在的“染料重分布”的缺陷，提高檢測(cè)靈敏度的同時(shí)也可用于高分辨率溶解曲線HRM。
 

▶  化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，適合長(zhǎng)期保存。
 

TaqMan 探針

TaqMan 探針基本可以滿足60%以上的qPCR實(shí)驗(yàn)，如常規(guī)的基因表達(dá)和拷貝數(shù)變異CNV實(shí)驗(yàn)。TaqMan 熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端（圖2）。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收; PCR擴(kuò)增時(shí), Tag酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。常用的熒光基團(tuán)是FAM，TET，VIC，HEX。
 

▲ 圖2 Taqman探針
 

MGB探針

對(duì)于要分辨單堿基差異的SNP實(shí)驗(yàn)，采用對(duì)堿基錯(cuò)配容忍度更低的MGB探針，在淬滅基團(tuán)后加入了DPI3基團(tuán)（圖3），從而提高了與靶標(biāo)結(jié)合的親和力；而且可以對(duì)靶點(diǎn)堿基進(jìn)行化學(xué)修飾，如PeptideNucleic Acid和Locked Nucleic Acid。
 

▲ 圖3 MGB探針
 

雙雜交探針

Taqman探針對(duì)探針的長(zhǎng)度有比較嚴(yán)格的要求，雙雜交探針則消除了這一“缺陷”。雙雜交探針是由兩條寡核苷酸單鏈組成，一條的3’端帶有供體熒光分子，另一條的5’端帶有受體熒光分子（圖4）。游離狀態(tài)下熒光供體會(huì)發(fā)出熒光，但當(dāng)兩條單鏈都匹配到模板鏈上時(shí)，就會(huì)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET，受體熒光分子就可以發(fā)出熒光，其熒光強(qiáng)度與生成的產(chǎn)物的量成正比。雙雜交探針的優(yōu)勢(shì)有兩點(diǎn)：擺脫了探針長(zhǎng)度的限制，較長(zhǎng)的探針可以提高與模板匹配的成功率；只有上下游兩條探針都正確匹配后才能檢測(cè)到受體熒光分子發(fā)出的熒光，特異性有所提高。
 

▲ 圖4 雙雜交探針
 

分子信標(biāo)探針

游離狀態(tài)下，分子信標(biāo)探針是一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其環(huán)狀部分的15-30個(gè)堿基可以與靶標(biāo)區(qū)域相結(jié)合匹配，下端的配對(duì)區(qū)域（左右一般各5-6個(gè)堿基）則由重復(fù)的GC組成，從而將5’的熒光分子和3’的淬滅基團(tuán)緊緊聚在一起，熒光發(fā)生淬滅；當(dāng)退火時(shí)，分子信標(biāo)探針解開(kāi)環(huán)并與模板靶標(biāo)雜交，這樣熒光分子和淬滅基團(tuán)的物理距離就變大了，熒光淬滅的前提就打破了（圖5）。除了MGB探針，分子信標(biāo)探針也非常適合用于SNP檢測(cè)。
 

▲ 圖5 分子信標(biāo)探針
 

除了上述幾種類型的探針之外，還有嘗試將引物和探針功能相結(jié)合的技術(shù)，如Amplifluor、LUX等，在設(shè)計(jì)難度上有所提高，但使用時(shí)更簡(jiǎn)便。各有其應(yīng)用的側(cè)重點(diǎn)和設(shè)計(jì)上的利弊，在此不多贅述。那么在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)該如何進(jìn)行選擇呢？在這里，給大家總結(jié)了一些兩種方法的區(qū)別，供大家參考。

表1 染料法和探針?lè)ǖ膮^(qū)別